（微生物学专业论文）灰树花真菌疏水蛋白hgfi在毕赤酵母中的表达、纯化及性质研究.pdf

摘要摘要真菌疏水蛋白是高等丝状真菌在特定时期分泌的一类具有特殊生物物理活性的小分子量蛋白质，约含有1 0 0 个氨基酸。这类蛋白质具有很高的表面活性，可以在两相界面处通过自我装配形成两性蛋白膜，进而改变原介质表面的亲水疏水性质，具有较高的理论价值和应用价值。灰树花真菌疏水蛋白h g fi 是本实验室从食用真菌灰树花g ，珈l af r o n d o s a中分离鉴定出的一个i 型真菌疏水蛋白。研究表明h g fi 具有很好的表面结合和修饰活性，在碳纳米管功能化、抗体固定化、生物医学材料表面修饰等封面均表现出优异的性能，具有很高的研究和应用价值。但由于灰树花真菌生长周期长、蛋白产量较低且分离纯化需要强氧化性酸三氟乙酸，限制了h g fi 的研究和应用。本文通过构建毕赤酵母表达载体p p i c 9 h g f l 并将其成功转入毕赤酵母细胞，实现了真菌疏水蛋白h g fi 在毕赤酵母中的大量表达。通过中空纤维膜超滤的方法，我们对毕赤酵母诱导表达的h g fi 进行了浓缩和脱盐。超滤脱盐、浓缩的重组h g fi ( r h g fi ) 在阳离子交换柱色谱层析中可以得到有效分离；s e p h a d e xg 7 5 凝胶过滤柱层析同样也可以实现对超滤样品的有效分离。经对两种色谱方法纯化的蛋白进行蛋白和电泳分析表明超滤法结合阳离子交换柱层析法更适合作为纯化r h g fi 的方法。对r h g fi 修饰的硅化玻璃及云母表面接触角的测定，表明酵母表达的r h g fi 具有和灰树花菌丝中提取的h g fi 同样的表面活性。运用x 一射线光电子能谱对r h g fi 修饰的硅化玻璃表面进行元素分析，也检测到表面上c 、n 元素含量的明显提高，进一步说明毕赤酵母表达系统可以成功实现h g fi 的活性表达。实验最后还对r h g fi 在组织工程材料修饰方面的应用进行了初步研究，表明r h g fi 可有效修饰聚己内酯( p c l ) 电纺丝支架的表面，有效降低p c l 支架的疏水性。关键词：真菌疏水蛋白h g f i 毕赤酵母表面活性接触角x p sa b s t r a c ta bs t r a c tf u a g a lh y d r o p h o b i n sa r eaf a m i l yo fl o wm o l e c u l a rw e i g h tp r o t e i n s ( a b o u tlo o a a )w i t hs p e c i a lb i o p h y s i c a lp r o p e r t i e s t h e ya r es os u r f a c e a c t i v et h a tt h e ya r er e a d yt os e l f - a s s e m b l ei n t oa m p h i p a t h i cp r o t e i nm e m b r a n e sa ti n t e r f a c e s ，c h a n g i n gt h eh y d r o p h i l i c i t yo ft h ec o r r e s p o n d i n gs u r f a c e s t h e ya r em o l e c u l e so fg r e a tt h e o r e t i c a la n dp r a c t i c a lv a l u e f u n g a lh y d r o p h o b i nh g fif r o mt h ee d i b l em u s h r o o mc r f o l af r o n d o s ai sat y p eih y d r o p h o b i ni d e n t i f i e db yo u rg r o u p h g fih a sb e e nf o u n dt op o s s e s sb o t hs u r f a c e b i n d i n ga n dm o d i f y i n ga c t i v i t i e s ，c a p a b l eo ff u n c t i o n a l i z i n gc a r b o n a n o t u b e s ，i m m o b i l i z i n ga n t i b o d i e sa n dm o d i f y i n gb i o m e d i c a lm a t e r i a ls u r f a c e sw i t he x c e l l e n tp e r f o r m a n c e h o w e v e r 。t h el i m i t e dr e s o u r c e so fh g fid u et og f r o n d o s a sl o n gl i f e c y c l e ，l o wp r o d u c t i o na n dt r i f l o u r o a c e t i ca c i d - d e p e n d e n te x t r a c t i o nr e s t r i c t e dt h et h e o r e t i c a la n dp r a c t i c a lr e s e a r c ho ft h i sp r o t e i n i nt h i sw o r k ，t h em a s s - p r o d u c t i o no fh g f1w a sa c h i e v e db yc o n s t r u c t i n gay e a s te x p r e s s i o nv e c t o ra n dt r a n s f o r m i n gi ti n t ot h ep i c h i ap a s t o r i sc e l l s h g fie x p r e s s e db yp p a s t o r i sw e r ef i r s t l yc o n c e n t r a t e da n dd e s a l t e db yu l t r a f i l t r a t i o nu s i n gh o l l o wf i b e rf i l m s t h ed e s a l t e dr e c o m b i n a n th g fi ( r h g fi ) c o u l dt h e nb es e p a r a t e df r o mc o n t a m i n a n tp r o t e i n sw i t hc a t i o n - e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h yu s i n gap r e p a c k e dr e s o u r c eqc o l u m n g e lf i l t r a t i o nc h r o m a t o g r a p h yu s i n gs e p h a d e xg 7 5m e d i u mc a na l s os e p a r a t et h er h g f1w i t hi d e a lp u r i t y p r o t e i nq u a n t i f i c a t i o na n de l e c t r o p h o r e t i ca n a l y s i so fr h g fie s t a b l i s h e dc a t i o ne x c h a n g ea sa l lo p t i m u mm e t o df o rr h g fip u r i f i c a t i o n w a t e rc o n t a c ta n g l ea n a l y s i so fs i l i c o n i z e dg l a s sa n dm i c as u r f a c e sm o d i f i e db yt h er h g fis u g g e s t e dt h a ti ts h a r e dt h es a m es u r f a c ea c t i v i t yw i t hn a t i v eh g fi x r a yp h o t o e l e c t r o ns p e c t r o m e t r ya n a l y s i so fe l e m e f a t so ns i l i c o n i z e dg l a s ss u r f a c e sc o a t e dw i t hr h g fis h o w e de l e v a t e dl e v e lo fc a r b o na n dn i t r o g e ne l e m e n t s ，s u g g e s t i n gt h ee x i s t i n go fap r o t e i nm e m b r a n eo nt h es u r f a c e t h i si sa l s og o o di n d i c a t i o nt h a tp p a s t o r i si sa ni d e a le x p r e s s i o ns y s t e mf o ra c t i v ee x p r e s s i o no fh y d r o p h o b i n s p r e l i m i n a r yr e s e a r c ho fr h g fia p p l i c a t i o ni nm o d i f i c a t i o no ft i s s u e e n g i n e e r i n gm a t e r i a ls u r f a c e ss h o w e dt h a tt h er h g fic o u l dm o d i f ye l e c t r o s p u ni ia b s t r a c te p s i l o n - p o l y c a p r o l a c t o n es c a f f o l d s ，o b v i o u s l yr e d u c i n gt h eh y d o r p h o b i c i t yo fp c ls c a f f o l d s k e yw o r d s ：f u n g a lh y d r o p h o b i n sh g fip i c h i ap a s t o r i ss u r f a c ea c t i v i t yc o n t a c ta n g l ex p si i i南开大学学位论文使用授权书根据南开大学关于研究生学位论文收藏和利用管理办法，我校的博士、硕士学位获得者均须向南开大学提交本人的学位论文纸质本及相应电子版。本人完全了解南开大学有关研究生学位论文收藏和利用的管理规定。南开大学拥有在著作权法规定范围内的学位论文使用权，即：( 1 ) 学位获得者必须按规定提交学位论文( 包括纸质印刷本及电子版) ，学校可以采用影印、缩印或其他复制手段保存研究生学位论文，并编入南开大学博硕士学位论文全文数据库；( 2 ) 为教学和科研耳的，学校可以将公开的学位论文作为资料在图书馆等场所提供校内师生阅读，在校园网上提供论文目录检索、文摘以及论文全文浏览、下载等免费信息服务；( 3 ) 根据教育部有关规定，南开大学向教育部指定单位提交公开的学位论文；( 4 ) 学位论文作者授权学校向中国科技信息研究所和中国学术期刊( 光盘) 电子出版社提交规定范围的学位论文及其电子版并收入相应学位论文数据库，通过其相关网站对外进行信息服务。同时本人保留在其他媒体发表论文的权利。非公开学位论文，保密期限内不向外提交和提供服务，解密后提交和服务同公开论文。论文电子版提交至校图书馆网站：h t t p ：2 0 2 1 1 3 2 0 1 6 1 ：8 0 0 1 f i n d e x h t m 。本人承诺：本人的学位论文是在南开大学学习期间创作完成的作品，并已通过论文答辩；提交的学位论文电子版与纸质本论文的内容一致，如因不同造成不良后果由本人自负。本人同意遵守上述规定。本授权书签署一式两份，由研究生院和图书馆留存。作者暨授权人签字：2 0年月日南开大学研究生学位论文作者信息馆，非公开学位论文须附南开大学研究生申请非公开学位论文审批表。南开大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任由本人承担。学位论文作者签名：年月日第一章前言第一章前言第一节真菌疏水蛋白概述真菌疏水蛋白是高等丝状真菌在特定时期分泌的一类具有特殊理化性质的小分子量蛋白质，约含有1 0 0 个氨基酸，分子量大小为l 1 0 4 道尔顿左右。根据水缘性图谱以及装配成的两性蛋白膜的溶解性等特征，真菌疏水蛋白可以分为两类：i 型和i i 型乜1 。i 型真菌疏水蛋白自我装配形成的蛋白膜具有高度的不溶解性，即使在1 0 0 c 水浴时也难溶解于2 s d s ，仅在过氧甲酸矛f l t f a 等极少数有机溶剂中解聚、溶解，以裂褶菌中的s c 3 、双孢蘑菇中的a b h l 和粗糙脉胞菌中的e a s 为代表1 ；i i 型真菌疏水蛋白自我装配形成的蛋白膜则可以在2 s d s或6 0 乙醇等很多溶剂中解聚、溶解，在增大压力或冷冻过程中也可以解离成疏水蛋白单体，以瑞氏木霉中的h f b i 、h f b i i ，荷兰榆树病菌中的c u 为代表璐引。真菌疏水蛋白可以在两相界面处通过自我装配，形成纳米级厚度的两性蛋白膜，使疏水性表面的亲水性增强，而亲水性表面的疏水性增强，是已知的表面活性最高的蛋白之一，具有很高的理论价值和应用价值真菌疏水蛋白基因的同源性和蛋白的相似性很低，只有相对保守的八个半胱氨酸位点，形成四个二硫键环状结构，其中第二个和第三个、第六个和第七个半胱氨酸总是连在一起口1 ，一级结构通式如下：x 2 3 8 一c x 5 9 一c c xl l - 3 9 _ 一c x 8 2 3 一c x 5 9 一c c x 6 1g c x 2 1其中c 代表半胱氨酸，x 代表除了半胱氨酸和色氨酸以外的氨基酸。真菌疏水蛋白第一个半胱氨酸前的氨基酸序列差异较大，而且很多疏水蛋白存在着糖基化。在i 型真菌疏水蛋白中，紧接着半胱氨酸双联体( c y s ：- c y s 。乖l c y s 。- c y s ，)之后的氨基酸大部分为亲水性氨基酸，而在i i 型真菌疏水蛋白则多为疏水性氨基酸相连；此外，与i i 型真菌疏水蛋白的相比，在i 型疏水蛋白第3 和第4 个半胱氨酸之间的氨基酸数目要多一些，这两点可能是造成两种类型真菌疏水蛋白在性质上差异的重要原因陋引。由于真菌疏水蛋白的特殊表面活性及应用潜力，从9 0 年代真菌疏水蛋白初次被鉴定出以来，真菌疏水蛋白的研究已经涉及第一章前言多个方向。真菌疏水蛋白的研究主要集中于以下几个方面111 真菌琉水蛋白的生物功能真菌疏水蛋白在丝状真菌生长发育的特殊时期高度表达，如气生菌丝形成、孢子萌发时期，对真菌的生长起到非常重要的作用，具有较为特殊的生物学功能。目前真菌疏水蛋白在真菌生命周期中以下几个方面有重要意义：11 11 帮助真菌克服气液屏障形成气生结构真菌形成气生结构的第一个步骤是长出液体培养基至空气中，而克服培养基表面张力的屏障是先决条件“。在水和空气的界面，表面张力很高，可达到7 2 枨m ，当裂褶菌形成气生结构时，水的表面张力由7 2 州m 降到4 5n l _ q m ，有时甚至能到3 0 刑m “。；。这与裂褶菌分泌疏水蛋白s c 3 有关s c 3 在培养基和空气表面自我装配形成疏水蛋白膜，可以非常有效的降低培养基的表面张力，使裂褶菌菌丝形成气生结构( 图il1 ) “1 。裂褶茁性i 麓一”“訾l 。：。习f 一l降低培养基的表面张力e 罐= ；：三裔。 。-一一-r 。-匿= 蠹：雪濂盖翕图il 裂褶菌气生菌丝形成示意图“1第一章前言裂褶菌s 0 3 缺陷株也能够降低培养基表面张力，可能是裂褶菌的其它蛋白或其它疏水蛋白造成的，但表面张力降低的相对较小，裂褶菌虽然形成气生结构，但形成的气生茵丝比较少。而在培养基中加入s c 3 后，又可产生大量的气生菌丝，说明疏水蛋白s c 3 对裂褶菌降低培养基表面张力，形成气生结构是非常必要的【1 2 】o表面活性剂有降低液体表面张力的能力，而大多数的表面活性剂对细胞膜都有毒性，而真菌疏水蛋白在细胞壁外自我装配形成聚合物，很难穿透细胞壁，这也许是疏水蛋白对真菌没有毒性的原因。1 1 1 2 赋予真菌菌丝以疏水性气生菌丝分泌的真菌疏水蛋白在菌丝表面自我装配成蛋白膜，其亲水面朝向细胞壁而疏水面暴露在空气中，因此气生菌丝表现为疏水性，如敲除裂褶菌的s c 4 疏水蛋白基因，其缺陷株的菌丝表面表现为亲水性n 引。真菌疏水蛋白还覆盖于真菌的其它气生结构，如子实体、产孢菌丝和孢子的表面、子实体和地衣内部通气孔道的表面甚至一些真菌的营养菌丝的表面。疏水性表面有利于孢子的扩散和营养菌丝的分散，而通气孔道的疏水性，对真菌在潮湿环境下进行气体交换是必须的n4 l 。目前还不知道为什么有些疏水蛋白覆盖在营养菌丝的表面，推测与通气培养有关。1 1 1 3 提高病原菌的致病性、植物致病菌在侵染宿主细胞的第一步是吸附于宿主细胞的表面，形成附着泡( a p p r e s s o r i u m ) ，然后穿入宿主细胞壁进行感染。稻瘟病菌( m a g n a p o r t h eg r i s e a ) 疏水蛋白m p g l 在病菌吸附于宿主细胞过程中起着重要作用，研究表明，m p g l 的稻瘟病菌缺陷株在吸附以及形成附着泡的能力均大大减弱5 1 。m p g l 的吸附作用机理，很可能与裂褶菌疏水蛋白s c 3 吸附于疏水性t e f l o n ( 聚四氟乙烯商品名) 表面的机理相同，即真菌疏水蛋白膜的疏水一侧与疏水性的菌丝表面作用，使稻瘟病菌有效的吸附于宿主表面，形成附着泡，再由附着泡的细胞膨胀压力穿入宿主菌n 引。早在1 9 7 4 年，真菌疏水蛋白的概念还没有提出时，在对后来归类为ii 型真菌疏水蛋白的荷兰榆树病菌疏水蛋白c u 的研究中发现，纯化后的c u 注入榆树中，会引起榆树的枯萎、树叶蒸发作用。呼吸作用的降低，因而认为c u 是一种第一章前言细胞毒素n7 1 。后续的研究中发现，c u 的缺陷株仍可以造成榆树的枯萎，而在非致病性的天然荷兰榆树病菌中表达c u ，也不能感染宿主菌畸1 。目前推测为，疏水蛋白c u 可以自我装配形成并稳定气泡，阻碍木质层的通透性，造成榆树的枯萎，如果这一理论成立，则所有的真菌疏水蛋白均有致病性n8 。相比较而言，ii 型真菌疏水蛋白自我装配形成的蛋白膜不很稳定，更容易解聚形成单体，单体的重新聚合使其能够不断的阻碍木质层的通透性，而目前尚未有i 型真菌疏水蛋白具有致病性的报道，能够对这个推测予以完善n 剐。1 1 1 4 对真菌的保护作用研究发现裂褶菌疏水蛋t 3 s c 3 对细胞壁基质的交联也起作用，其作用于细胞壁中几丁质以1 ，3 1 ，6 - 1 3 一糖苷键对葡聚糖的连接，可以使细胞壁更加完整n 引。真菌疏水蛋白覆盖在真菌的表面，可以保护真菌细胞抵抗恶劣环境，如化学试剂与酶的处理等。真菌疏水蛋白具有很弱的免疫原性，其覆盖在真菌表面屏蔽了其它抗原，使病源真菌能抵抗免疫系统攻击n 引。1 1 2 真菌疏水蛋白的结构研究1 1 2 1 真菌疏水蛋白的一级结构尽管真菌疏水蛋白的氨基酸序列保守性较低，但其一级结构中八半胱氨酸及其分布模式的高度保守性却暗示这八个半胱氨酸残基对真菌疏水蛋白的结构和活性的重要性。研究表明，真菌疏水蛋白s c 3 中的二硫键并不直接参与其单体蛋白的自组装聚合过程，而是对其聚合前的蛋白结构起到稳定的作用以防止其在溶液中提前自组装聚合 2 0 , 2 1 1 ，而m a c k a y 等在对e a s 的研究中也发现类似的结果【2 2 】o目前对真菌疏水蛋白一级结构中二硫键的排布方式有以下两种观点：一种是传统观念上的依次排列，即第一个和第二个、第三个和第四个半胱氨酸相连，以此类推，如图1 1 2 ( a ) 所示；第二种结合方式是近些年来，根据疏水蛋白晶体结构或质谱结果推测出的【2 3 1 ，配对顺序为第一个与第六个，第二个与第五个，第三个与第四个，第七个与第八个半胱氨酸，如瑞氏木霉中的h f b i i 与粗糙脉胞菌( n e u r o s p o r ac f a s s a ) 中的e a s ，如图1 1 2 ( b ) 所示。4第一章前言图12 推测的i 型疏水蛋白5 c 3 和i i 型疏水蛋白c u 的二硫键结合方式( a )及已发现的h f b i i 的二硫键结合方式( b )1122 真菌琉水蛋白单体构象的研究真菌疏水蛋白做为单体蛋白可以在界面处通过自组装形成聚合体的能力县有重要的实际和应用价值，如果可以对其自组装的机制和生物物理学原理有较为透彻的理解。对我们从头设计功能、活性更符合目的和实际需要的蛋白分子具有重要的理论和实际意义。对真菌疏水蛋白单体结构的研究可以为探究真菌疏水蛋白自组装分子机制提供重要的依据。目前对真菌疏水蛋白单体结构的研究方法主要是x 一射线晶体衍射及三维核磁共振技术。随着生物信息学的发展，也实现了利用编写的程序和算法来较可信地模拟蛋白结构的方法，目前也已经有用软件模拟真菌疏水蛋白结构的报道，与通过实验法测定的结果较为吻合。用x 射线结晶学研究空间构象是目前最准确的蛋白质构象研究方法，但由于疏水蛋白存在聚合和自组装的预蔷状态，还有它们在溶解状态下的混乱状态，使得报难得到适合晶体结构。2 0 0 4 年，芬兰l j n d e r 研究小组与j o e n s u u 大学合作，首次报道了瑞氏木霉疏水蛋白h f b i i 的晶体结构，分辨率达到l a ，并从分子水平解释了瑞氏木霉疏水蛋f | h f b i i 的成膜原理“；2 0 0 6 年，进一步研究将h f b i i 的分辨率达到了07 5 a 。“；随后，该小组有成功的获得f h f b i 的晶体，还有一种改造过的h f b z 的结构( n - c y sh f b i ：即在n 端连接1 3 个氨摹酸残基，p d b 代号为2 g v m ) 。但至今，尚未有i 型真菌疏水蛋白晶体结构的报道”。图l _ 13 为瑞氏术霉疏水蛋白h f b 系列的空间结构示意图这一结构模型与己塑= 皇亘蔓知的任何蛋白模型均不相同。i s b i i 的整个分子为球状，直径约2n m ，具有个由两个b 发夹组成的0 结构中心和一个。螺旋结构。在l i f b i i 的一级结构中，第一个b 发夹位于蛋白的n 端附近，第二个位于c 端附近，这两个发夹互相联合、镇定，形成b 折叠桶。在两个b 投夹之间，剧j l t f b i i 一级结构中，中部的氨基酸残基形成了n 螺旋结构。在三级结构中，这个a 螺旋处于桶装b 桶的外侧。根据瑞氏术霉疏水蛋e i l i f b i i 的空间构象，可以推测其一级结构中8 个半胱氨酸残基结合形成二硫键的方式，第一个半胱氨酸与第六个半胱氨酸、第二个与第五个、第三个与第四个、第七个与第八个分别相连。这些二硫键在三级结构中形成两个连续的单元，这些单元从蛋白的两边贯穿整个分子，使h f b i i 整个分子得到有效的交联，因而有效的稳定疏水蛋白h f b i i 的空间构象，使其保持球状结构。瑞氏术霉疏水蛋白h f b i 的晶体与h f b 儿非常相近，推测瑞氏术霉中另一种疏水蛋白h f b i i i 也属于这个结构模型删。，! 娉，一p “77 、f u f 妒- )夸鐾笃。j 谚。蛰图l3 1 i b 系列蛋白的三维结构。( a ) h f b i i 的空间结构元件示意，其含有两个b 发夹形成个中心的b 折叠结构：( b ) h f b i i 的空问结构填充示意，红色为c 端，带负电。蓝色为n 端，带正电，下部绿色为b 折叠的疏水区，上部为。螺旋的亲水区；( c ) 两种h f b l 分子重叠示意图，黑箭头所指为h p b i 的七个氮基酸残基组成的环状结构，黄色为h f b i ，蓝色为n c y sh f b i ：( d ) h f b i 的空间填充模型。红色为c 端，带负电，蓝色为n 端，带正电，上部为疏水结构，下部为亲水结构。第一幸前占鬻霉留目l r 一；二夕图l4e s 的三维结构。( a ) e a s 的空间元件示意，黄色为二硫键，甑色和蓝色为带电荷残基( b ) e a s ( 2 色) 与h f b i i ( 黄色) 的重叠示意图。( c ) e s 的空间结构填充图，灰色为无电部分，红色为负电残基，蓝色为正电残基。此外，粗糙脉胞菌中的e a s 的空间结构也已经用核磁共振进行了详细研究。e a s 的核心结构也是由两个相互连接的b 发夹所形成的四链状b 桶状，表现出与电荷隔离和强大的疏水性。在相对于h f b i i 中a 螺旋位置上，有一个小的双链反向平行的折叠 2 2 , 2 ”。此外，它还含有一个很长的( 约2 4 个残基) 的无序环状序列在第三与第四个半胱氨酸之间，这是i 型与ii 型疏水蛋白的显著差别。这个环状序列在i 型疏水蛋白中是保守性最差的，无论是长度还是氨基酸种类”7 。2 9 l 。1123 真菌琉水蛋白组装结构的研究杆状结构是i 型真菌疏水蛋白自组装后形成的蛋白膜最显著的结构特征。当i 型真菌疏水蛋白溶液滴在固体支持物上干燥后可以通过电镜( e l e c t r i cm i c r o s c o p y ，e m ) 或原子力显礅镜( a t o m i cf o r c e m i c r o s c o p y ，a f m ) 观察到纳米级的棒状物镶嵌式地聚在一起【2 ”，如图ll5 所示。这些小棒可能是在空气与真菌疏水蛋白溶液的界面处形成，并随着液体不断蒸发而沉淀在固体支持物表面。图151 型真菌疏水蛋白s c 3 的杆状结构标尺为1 0 0 n m ，通过e m 和a f m 对真菌表面的形态观察，也可阻观察到类似的棒状结构，但这不能够成为真菌疏水蛋白吸附在菌丝表面的依据，因为其他物质也能形成这种杆状结构，如淀粉等脚l 。因此，i 型真菌疏水蛋白的杆状结构也经常被称为淀粉状杆状结构( a m y l o i d - l i k er o d l e t ss t r u c t u r e ) ，杆状结构的大小根据不同的疏水蛋白以及产生方式的不同而有所差异，直径约从5 - 1 5 纳米，长度可以在1 0 0 纳米以上【“圳，如图ll6 所示。鎏戮“图叠、l 麓图16 透射电子显微镜( g e m ) 下粗糙脉胞菌( # e u r o s p o r ac r a s s a ) 孢子表面e a s 形成的棒状结构。i i 型真菌疏水蛋白直接在固体支持物上干燥，用e m 或a f m 进行观察，没有特异性的结构。此外，真菌疏水蛋白可以形成l a n g m u i r 膜，它是一种分子有序排列的有机体单分子膜，它浮在液体表面( 一般为水表面) 。可以改变流体表面的性质，如表面张力、蒸气的沉积系数、蒸气压等j 。l a n g m u i p b l o d g e n 膜( l b 膜) 又称垂直累计膜法，是将单分子膜转移到垂第一章前言直插入液体的固体载体上的膜，可形成单层或多层，是1 9 3 5 年美国科学家l a n g m u i r 和他的学生b l o d g e a 提出的，其形成的过程由图1 1 7 所示。拦毙彦一+ 图1 7l a n g m u i r - b l o d g e t t 膜形成示意图。左图中可以看到浸在水中的固体载体和溶液表面的l a n g m u i r 膜，将固体载体向上拉变为右图，溶液表面的l a n g m u i r 膜转到了固体载体上，形成l a n g m u i r b l o d g e t t 膜。l a n g m u i r - s c h a e f e r 膜( l s ) 膜是由s c h a e f e r 提出的，因此命名，是一种水平附着的累积膜法，通过反复的制作可以形成多层膜，形成的示意图如图1 1 8 。if登泌澎魏瓣磷蕊赫馘础姒黼删赫一姒图1 8l a n g m u i r s c h a e f e r 膜形成示意图。左图中可以看到固体载体贴在溶液表面的l a n g m u i r 膜上，将固体载体向上拉变为右图，则l a n g m u i r 膜转到了固体载体上，形成l a n g m u i r - s c h a e f e r 膜。2 0 0 3 年，芬兰l i n d e r 博士研究小组通过拉膜机，制备了第一个真菌疏水蛋白的l b 膜一瑞氏木霉h f b i 的l b 膜 3 l 】，2 0 0 7 年又进一步精确报道了瑞氏木霉疏水蛋白h f b i 的l b 膜结构。将单层的h f b i 蛋白膜转到亲水性的云母表面，裸露在外面的是h f b i 蛋白膜的疏水性表面，通过原子力显微镜观察如图1 1 9 ( a ) 所示1 2 引。总体看来，其含有规则的网状结构，每个网孔周围又具有形成六面体结构的小网孔，膜的厚度在2 3 n m 。经过多次拉膜，瑞氏木霉疏水蛋白h f b i 可以形成1 6 层的l b 膜，其表面结构与l b 单层膜相近。h f b i 的l s 膜如图1 1 9 ( b ) 所示，其将h f b i 膜转到了疏水性的石墨( h i g h l yo r i e n t e d p y r o l y t i cg r a p h i t e ，h o p g ) 表面，原子力显微镜观察到的是亲水性一侧，9第一章前言其l s 膜与l b 膜的厚度相近，而结构上有一定的差异，目前，已经有数个其它真菌疏水蛋白l b 膜、l s 膜的报道1 3 2 - 3 | 5 。、怅二“o参。惹il j喜i爱溅图i9 瑞氏术霉疏水蛋白肿i 的l b 膜与l s 膜的 f f 照片。图a 为h f b i 的l b膜，图b 为l s 膜，右边为放大的图像左图的标尺为2 0 h m ，右图的标尺为l 珊。11 3 真菌疏水蛋白的生产及纯化真菌疏水蛋白具有特殊的理化性质不同类型的疏水蛋白的分离方法也不相同，以下为几种典型方法。1131 三氟z 酸法i 型真菌疏水蛋白聚合物具有特殊的溶解性质，最常用的提取方法为三氟乙酸法，即利用聚合物不溶解于热s d s 而溶解于t f a 的性质，目前这种分离方法广泛应用于真菌疏水蛋白的实验室研究中，但此方法使用了t f a ，t f a 是一种高腐蚀性的强酸，很难将规模放大，实现产业化。对于茵丝、孢子、于实体表面的聚合物，可以直接通过热s d s 处理然后用t f a 将疏水蚩白聚合物解聚，超声波作用可以加快解聚的速度，将通常两小时的反应时间缩短为几分钟。用氮气除去t f a 后，将剩余的物质溶解于水，便可得到真菌疏水蛋白单体m ”1 。具体的操作中，有的时候在热s d s 处理后，还要经过3 ：l 的氯仿甲醇处理，除去菌丝表面的非共价酯类，以保证t f a 的解聚效果；氮气吹干后，也可以先将疏水蛋白溶解于6 0 的乙醇中，透析或冷冻干燥除去乙醇后，再溶解于水中，可以得到相对纯度较高的真菌疏水蛋白单体。第一章前言液体培养时，真菌在生长过程中，将疏水蛋白单体分泌到液体培养基中，随后，疏水蛋白吸附于菌丝表面形成聚合体，或在液体培养基的表面形成，因此，液体培养基中存在一定量的真菌疏水蛋白单体。为了提取这部分疏水蛋白，可以通过鼓入空气、搅拌等方法，在培养基中制造相界面，使真菌疏水蛋白的单体转变为聚合物，离心分离到聚合物后，继续用t f a 进行抽提。1 1 3 2 温和条件提取i 型真菌疏水蛋白的方法从i 型真菌疏水蛋白的最初研究起，人们努力摆脱有极强酸的限制，力争发现不依赖于三氟乙酸的真菌疏水蛋白分离方法，目前国际上共报道了两种不用t f a 分离裂褶菌疏水蛋白s c 3 的方法。裂褶菌分泌s c 3 的同时分泌一种多糖裂褶菌素( s c h i z o p h y l l a n ) ，裂褶菌素能够稳定水溶性的s c 3 低聚体，并促进其吸附于亲水介质的表面，可以通过疏水层析法从发酵清液中分离i 型疏水蛋白，但这种方法目前只应用于s c 3 的分离纯化中，其是否与s c 3 的n 端氨基酸糖基化有关尚不可知h 3 。另一种方法是将s c 3 吸附于疏水性的介质表面，如疏水性树脂，s c 3 在疏水性表面形成的蛋白膜可以通过o 1 的t w e e n - 2 0 洗去，从而得到s c 3 单体，这种方法已经申请了国际专利。1 1 3 3i i 型真菌疏水蛋白分离方法相比较i 型疏水蛋白，ii 型真菌疏水蛋白的分离纯化方法简单的多。ii型疏水蛋白所装配成的蛋白膜可以在6 0 的乙醇等很多有机溶剂中解聚并溶解，而绝大多数蛋白在有机溶剂中变性，此方法分离得到的疏水蛋白纯度很高。在早期的研究中，曾经通过0 1 t f a 一2 0 乙腈直接从瑞氏木霉菌丝表面分离疏水蛋白h f b i 。t w e e n 一2 0 、t r i t o n 一1 0 0 、s d s 等表面活性剂均可以从菌丝表面分离疏水蛋白，相比有机溶剂而言，表面活性剂抽提效果较好，但杂蛋白含量也较高。相比较而言，s d s 是目前工i 型真菌疏水蛋白最常用抽提试剂，后续工作中可以用k c l处理，沉淀除去大部分的s d s 。1 1 3 4 双水相系统分离法双水相系统( a q u e o u st w o p h a s es y s t e m ，a t p s ) 又称双水相萃取( a q u e o u st w o p h a s ee x t r a c t i o n ) ，是一种发展很快的生物物质萃取分离系统，是利用物第一章前言质在互不相溶的两水相间分配系数的差异来进行萃取的方法，不同的高分子溶液相互混合可以产生两相或多相系统，常常应用于疏水性蛋白( 如膜蛋白和疏水蛋白) 的初步纯化。b e r 0 1 5 3 2 可以用于浓缩瑞氏木霉疏水蛋白h f b i 、h f b i i 溶液，经过b e r 0 1 5 3 2与水饱和正丁醇的双重萃取，可以直接将瑞氏木霉的发酵液中的疏水蛋白浓缩，得到高浓度的疏水蛋白溶液，然后进行后续的纯化瑞氏木霉菌丝表面分离得到的h f b i 溶液也可以用b e r 0 1 5 3 2 进行浓缩，再经过s e p h a d e xg 一2 5 凝胶过滤层析和q - s e p h a r o s e 离子交换层析，可以得到纯度很高的h f b i 。双水相系统用于真菌疏水蛋白的分离也有其受限制的一面，目前b e r 0 1 5 3 2仅仅在分离瑞氏木霉h f b i 和h f b i i 中效果较好，并不适用于所有真菌疏水蛋白的抽提，而且b e r 0 1 5 3 2 为a k z on o b e ls u r f a c t a n t s 公司产品，在国内尚未发现性质与其相似、价格低廉的替代品。1 1 4 真菌疏水蛋白的应用研究真菌疏水蛋白在食用真菌中广泛存在，因此认为它们无毒性，在食品中使用是安全的。另外，数据初步显示真菌疏水蛋白既无细胞毒性，也无强免疫原性，因此认为在医学使用中是安全的。真菌疏水蛋白具有特殊的理化性质，其自我装配的性质赋予其很多潜在的应用。同时，真菌疏水蛋白还具有很好的蛋白、核酸固定化功能。已经有研究表明真菌疏水蛋白形成的蛋白膜不仅对抗体、酶有较好的固定化效果，还可以更好地保持相应酶类的活性。因此，目前对真菌疏水蛋白的应用研究主要是基于真菌疏水蛋白的特殊理化性质及其固定化能力。当前对真菌疏水蛋白可能应用的领域有以下几个方面：1 1 4 1 双水相纯化系统标签瑞氏木霉疏水蛋白h f b i 、h f b i i 在双水相系统( a t p s ) 中表现出比任何其它已知蛋白都强烈的极端分离行为，鉴于在a t p s 中可以进行有效的分离，疏水蛋白h f b i 、h f b i i 可以作为选择性纯化标签，纯化所感兴趣的融合蛋白。芬兰l i n d e r 博士研究小组将内切葡聚糖酶i ( e n d o g l u c a n a s ei ，e g i ) 基因与瑞氏木霉疏水蛋白h f b i 基因连接在一起，在瑞氏木霉体系中表达，每升发酵液中融合蛋白e g i h f b i 的表达量达到克级水平。由于h f b i 的存在，融合蛋白在a t p s 中可以有效地分散到表面活性剂b e r o l 5 3 2 相中，经过a t p s 系统分离后，大大简化了1 2第一章前言纯化工艺，而且e g i 的活性并不丧失。双水相抽提为瑞氏木霉疏水蛋i 刍h f b i 提供了一种易于实现的、廉价的、有效的分离纯化途径，在工业生产中具有很大的潜f 1 3 8 , 3 9 j 。1 1 4 2 蛋白( 酶) 、核酸和细胞的固定化真菌疏水蛋白在介质表面上有序而坚固的自我装配，使得它们适于完成表面修饰和固定化等功能。在瑞氏木霉疏水蛋白及其融合蛋白的研究中，h f b i e g i的融合蛋白可以高效的固定在硅烷化玻璃或是特富龙等疏水性材料表面，在疏水支持物表面形成紧密结合的刚性表面层。但瑞氏木霉的另一种疏水蛋白h f b i i ，尽管它自身可以与表面有效结合，但h f b ! ! 一e g i 核的融合蛋白固定化效果却很差。西班牙p a l o m o 博士研究小组将真菌疏水蛋白用于层析柱中，利用蛋白与蛋白之间的相互作用，改善脂肪酶在柱上的固定。他们没有使用融合蛋白，而是直接将平菇的疏水蛋白固定在亲水性的乙醛酸琼脂表面，再将脂肪酶固定在疏水蛋白的表面，经过酶活性测定，发现真菌疏水蛋白可以作为一种良好的中介，将酶类固定于亲水性的介质表面【4 0 】。除了固定酶类之外，也用真菌疏水蛋白的融合蛋白将抗体等不同蛋白固定到层析柱或者其它固体支持物表面，与常规的酶固定化技术相比，真菌疏水蛋白的融合蛋白可以使目的蛋白更有效的结合。2 0 0 6 年，芬兰l i n d e r 博士研究小组与赫尔辛基工业大学合作，将瑞氏木霉疏水蛋白h f b i 与核酸结合，为核酸的固定化提供了新的思路。他们在h f b i 的n 端加了一个半胱氨酸，并通过二硫键将其与一树状化合物结合，此树状化合物的另一端含有氨基集团，可以高效结合核酸，h f b i 的自我装配可以将核酸进行固定化，开创的新的核酸固定化手段】。强烈的固定特性也许还可用在固定细胞方面。将瑞氏木霉的h f b i 融合到啤酒酵母的细胞壁絮凝蛋白f l o i 上，就可以在酵母表面表达。f l o i h f b i 融合蛋白正确地暴露在酵母细胞表面。重组的酵母细胞在含有一种叫做聚氧乙烯c 1 2 1 8 e 0 5 的非离子去垢剂的a t p s 中表现得比非转化宿主细胞的分离效果更好。细胞表面特性分析说明h f b i 的表达使细胞更加非极性化，比天然啤酒酵母菌株带有稍少的负电荷。产生疏水蛋白的酵母向疏水的硅树脂基质材料上的结合力比原先倍增了，但并不能改进它向亲水载体上的结合效果。包被疏水蛋白第一章前言的这种生产菌株在需要进行酵母固定化的加工过程中有优点，因为向层析柱粘着时可以获得更高的生物量和更稳定的结合。1 1 4 3 乳化性质真菌疏水蛋白既含有亲水性集团，有含有疏水性集团，这种两亲的性质使疏水蛋白可以作为一种天然的乳化剂、表面活性剂。在油和水的混合物中分别加入真菌疏水蛋i 刍s c 3 、h f b i 、h f b i i ，可以观察到疏水蛋白可以使小油滴较稳定的在水中存在，不同的疏水蛋白乳化的能力也不同，相比较而言，h f b i 、h f b i i的效果好于s c 3 。真菌疏水蛋白可以作为洗洁产品的成分，改善食品对抗相变的能力并形成稳定的泡沫，可以用于促进土壤中的污染物降解和应用在石油泄露后的回收石油过程中。1 1 4 4 生物传感器电极的修饰2 0 0 4 年，波兰b i l e w i c z 研究小组研究了真菌疏水蛋白在电极上的自我装配以及装配后电极的性质。他们以彩色豆马勃的i 型疏水蛋白h y d p t 1 作为研究对象，将h y d p t 1 从水溶液中转移结合到如玻璃炭、薄汞膜等疏水性的电极材料表面，或是结合到亲水的金电极表面，疏水性表面h y d p t 1 的覆盖率非常高，比亲水性的金电极表面要高得多。实验结果表明，真菌疏水蛋白h y d p t 1 包被的电极对导电性复合物是有效的，疏水蛋白膜控制这些复合物从溶液向电极的通路。辅酶q 吸附在疏水蛋白膜的表面，而苯醌、偶氮苯等更小的物质，可以穿透疏水蛋白膜的小孔，吸附在电极表面。真菌疏水蛋白膜在大多的情况下都非常稳定，适应的p h 值范围也很宽，它可以非常有效地阻断了电极基质的氧化，并能使亲水性的电活性探针吸附于电极表面。真菌疏水蛋白膜可以作为一种电极的基质，也可以作为一种电极表面固定电活性分子的材料【4 2 硝】。1 1 4 5 发酵中泡沫的抑制在丝状真菌的工业发酵中，经常会产生大量的泡沫，主要原因是在发酵过程中，菌丝分泌的真菌疏水蛋白具有很强的表面活性，在振荡的培养基中会产生泡沫。如果泡沫过多，可能引起染菌，一般生产中在发酵液中加入消泡剂去除泡沫，但消泡剂很可能影响发酵水平并在提取产物时不易除去。b a i l e y 在瑞氏木霉的研究中，通过分子生物学手段，筛选得到疏水蛋白h f b l 、1 4第一章前言h f b 2 缺陷型菌株和高表达菌株。在瑞氏木霉的发酵过程中，缺陷型菌株的泡沫很少，而高表达菌株却产生了大量的泡沫，证明了真菌疏水蛋白与发酵泡沫有密切的关系1 4 6 。在生产中，如果通过基因技术敲除或诱导阻断疏水蛋白基因的表达，就会大大降低发酵罐的泡沫，避免引入消泡剂对生产和下游处理中带来的不便【4 6 1 。1 1 4 6 生物活性包被材料i 型真菌疏水蛋白具有非常稳定的自我装配特性，而且既无细胞毒性，也无强免疫原性，这使得它们在生物材料的表面包被应用中成为热点，例如在外科手术器械包被和内科移植等领域均有广阔的应用前