（动物学专业论文）环渤海区域四种林蛙形态学和染色体研究.pdf

环渤海区域四种林蛙形态学和染色体研究 摘要 环渤海区域是一个比较特殊和重要的地区，我国2 0 种林蛙中有7 种分布于 该区域，并且有昆嵛林蛙等本区域的特有物种。本文以该区域四种代表性林蛙 串圜栋蛙( 毖船触搿萝黼稃箩砖) 、昆嵛林蛙( 露觳谬雄瓣穰s 括) 、桓仁椿蛙( 麓 存溯甜黝翩酊s ) 和东北林蛙( 最拗d 矾靖西) 为研究对象，对其外部形态、骨骼 结构和染色体进行定性翔定量姥较分析，主要研究结果如下： 、四种林蛙蝌蚪存在明显的种间差异。不仅体型大小和腹部颜色等存在明 显差异，而且尾长、体长等亦有差异。在唇齿式方面，昆嵛林蛙为i ：卜1 l 一1 ： l l 或薹：量一王、恧中霹林蛙、桓仁林娃和东北林蛙为l ：3 3 l - 量：或差： 2 2 卜王：。其中蘑三种在副乳突等方蘧有各黧豹特点。编制的蝌蚪检索表可 以方便的对这四种林蛙的蝌蚪进行鉴定。 二、在对西种林蛙外部形态分析的基础上，重点对骨骼系统进行了解割和比 较分析。首先在国际上对我国林蛙的代表物种一中国林蛙的骨骼系统做了详细的 观察翻描述。四种林蛙无论在外部形态方面，还是在骨骼结构方面都具有一定的 种阕差异，进一步明确了桓仁林蛙与中匡林蛙、东冀艺林蛙的不同，丰富了挺仁棒 蛙作为一个独立的物种的证据。昆嵛林蛙与中因林蛙、东= e 林蛙和桓仁林蛙具有 较大的形态学差异，表现出相黠较远的亲缘关系。 三、对四种林蛙染色体核型和银染结果的比较分析，不仅第一次明确了昆嵛 林蛙的染色体2 n = 2 6 ，：倍体数、核型等明显不同于其他三种林蛙，而且表明桓 仁林蛙银染结果与其他三种不同。 总之，通过本研究不仅进一步说明环渤海湾区域林蛙生物多样性的复杂，孛 国林蛙、昆嵛林蛙、挺仁林蛙和东北林蛙在蝌蚪和成体的形态特征以及染色体核 型方面具有各自的特点，瑟嵛林蛙和桓仁林蛙是不同子中霞林蛙和东北林蛙的特 有物种；而且对蝌蚪形态特征的观察和检索表的编制将在环境监测、林蛙栖息地 和分布调查以及资源保护与利用等方面具有重要的价值和意义。 关键诩：林蛙，彤态，蝌蚪，骨骼，核型 乳u d i e so nt h em o r p h o i o g ya n dc h r o m o s o m eo ff o u r s p e c i e so fw o o df r o g si nt h ea r e aa r o u n db o h a is e a a b s t r a c t t h e 甜e aa r o u n db o h a js e ai sas p e c i a ia n di m p o n a n tz o n ei nc h i n a ，、i i f h i c hi n c i u d 鹊 s h 卸d o n g ，l i a o n i n ga n dh e b e ip r 0 、，i n s ，觞w 酬觞b e i j i n g 锄d1 1 a n j i nc 砌s e 帕n0 f t w e n t ys p e c i e s0 fw o o df n d g s ( a i s oc a l l e db r o w nf 旧g s ) i nc h i n ad i s t 曲u t ei nt h i sa 怆aa n d a m o n gt h e m ，毛棚，u e ，l s f a n dr ，u a 疗，鬯r ，e ，1 s ，sa r ee n d e m i c ns h o w sah i g hi e v e ii n b i o d i v e 噶耐a n d mp i - 酬o no fw 0 0 df r o g si nt h i sa 啥aa n dt h e i rp 叫0 9 e n i c 怆i a t i o n d t 乏i ) ( o n o m ya 伦u n r e i v e dp e 哟c t i y 1 no r d e rt og e tm o 哈i n f o r n l 绷o no nt h ed a s s 币c 绷0 n 。 e n v i r o n m e n t a ii n s p e c t i o na n d f o o df r o gp r o t e c 面o na n du 髓i i z a t i o n ，f o u rr e p r e s e n t a 髓v e s p e c i e so fw o o df r o g sw a ss e i e c t e da st h er e s e a r c h i n gm a t e r i a i si nt h i st h e s i s ，t h e ya r e 只： c h e n s i n e n s i s r k u n y u e n s i s 。 r h u a n r e n e n s i sa n dr d y b o w s k i 。n 、e 媳f n 乱 m o 巾h 0 i o g yo ft h e i rt a d p o l e sa n da d u h ，s k e i e t o ns y s t e ma n dc h r o m o s o m ew e 怕s t u d i e di n d e s c p t i o na n dq u a m i t a t i v ec o m p a n s o n s f j 例y ，t h ee ) ( 1 e m a im o r p h o l o g ya n dm o l j t h p a r t so ft h e 训p o i e so fr 叻嘲e ，陋s ，凡 地疗刖旧! ! 仃：s 活，r ，u 舌唧e ，硷惦砖a n d 只d 勃铷耐【：i ：w e 怕o b s e r v e da n dm e a s u 限du n d 钟 s t e 伧o s c o p e 1 1 1 ee x t e m a ia n do 例m o 巾h o l o g i 酬c h a 甩c t e r i s t c sh a v es p e c i 豁t 0s p e c i e s d i 仟e r e n a m o n gt h e m 1 1 1 eb o d ys i z ea n dc 0 1 0 ri nv e n t e ra m o n gt h ef o u rs p e c i e s 鹏怕 s i g n 币c 卸u yd 酐e 悖n t ，a n dt a i li e n g t h 钔db o d yi e n g t h 骶a i s od i 仟e r e mb yt - t e s t 锄a i y s j s t h el a b 酬t 蛐r o w f o r n l u i ao fr 伽y u e 仃s ：s i si ：1 1 门1 ：i ia n di ：1 1 i i i 。w h i et h o s e 0 f 尺曲e n s ，仃e 仃s ，s ，凡，蝴e n 蛹钔d 只- d y 幻鹏黼a 怕i ：3 - 3 1 1 ：ma n di ：2 2 ，1 1 ： w i t hd i 仟e 怕n ts u b m a r g i n a lp a p i i l 1 1 h ec h e c k i s t0 ft h e s et a d p o l e sa t i a c h e di nt h ep a p e r f o ri d e n t 讯c a t i o n s e c o n d i y ，t h ea d u l te ) ( t e m a im o r p h o i o g y 钥ds k e i e t o nc h a r a c t e 惜w e r e0 b s e r v e da n d r n e a s u r e d t h es k e i e t o ns y s t e mo frc 咖e 疗s ，冶疗s ，sw a sd e s c r i b e dj n d e t a a n d c o m p a r i s o n sa m o n gt h ef o u rs p e c i e sw e 怕m a d ew i t ht t e s ta n a i y s i s 1 1 1 e 他s u i t ss h o w n t h a ts o m es i g n i f i c a r t t i y d i l 艳r e n a m o n gt h e s ew o o df 叼sa n di n d i c a t e dt h a t 只： 柚n 刖e 仃s si sd m e r e n tf r o mr 叻嘲e 仃s ，sa n dr 蛳m 偈肼a n dv a i di nt 纵o n o m y 只 丘u 几j ，u e 仃s f w a san e ws p e c i e s 蕾d u n da tm t k u n y u0 fs h a n d o n gp r o v i n i n2 0 0 2a n dw a s c o n s j d e 帕d 鹊rc ：，e 仃如鲫魄b u tt h e 鹏u 胎s h a w n 挫w d i f f e 怕n t 仃o m0 t h e rs p e c i 胬 nt h ea 怕aa r o u n db o h a is e aa n dm a y b eh a v ea r e l 绷v e i yu n e r i o r 陀l a t i o n s h i p 州t ht h e o t h e rt h 陀es p e c i 鼹1 1 1 ；si sa i s oc 0 哺m e db yt h ec h r o m o s o m ed a t ai j s t e dj nt h en e t p a 几 f i n a i i y c h r o m o s o m ea n a i y s i si sau s e m 酣1 0 di n t a x o n o m y 1 1 1 e 他s u l t so f i 暑时雠y p ea n a i y s i ss h o w nt h a tr 舡f 一灿f e ， s s ( 2 n = 2 6 ) j sm u c hd i f f e 伧m 行o mr 叻8 n s 仃e 仃s s ，r u a 疗，1 鲫鲫s sa n dr 咖幻吣肼( 2 n = 2 4 ) i ti st h ef i r s tt i m et or e i ) o r tt h e k a 哆。帅e0 fr 肌啊刖e n s s 钥da g - n o 只so fr 觑，a ，门鲫鲫始 i n n c i u s j o n ，t h ef o u rs p e c i e s0 fw o o df 1 o g si nt h ea r e aa r o u n db 0 h a js e ah a v e d i s t i n c t i y d 怕mc h a 眦t e r i s t i i n m o r p h o i o g y0 f 俐p o i ea n da du | t s k e i e t o n a p p e 姗，k a 呻t y p ea n da g - n o r s r 细川 旧仃始钔d 只加f a ，r e 门e ，l s ，sa 阳“v 0v a i d s p e c i 髂f r c mr 叻鲫咖鲫s 翘钔dr 咖的吣航t h e c h e c k 瞰o f 协d p o i e si nt h ef i r s tp a r t i su s e f u la n di m p o n a n ti n 稍i e ds u n ，e y ，e n v i r o n m e n t i n s p e c 吐o n ，b i 0 i o g i c a ii n d i c a t o rj n e n v i r o n m e ma n dw 0 0 df n o gp f o t e c t j o n 钔d 删肛z a i t j o n k e yw o r d s ：w o o df r o g ， m o r p h 0 1 0 9 y ，t a d p 0 i e ，s k e i e t o ns y s t e m ，k a 咣埘p e l i i 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是在导师的指导下取得的研究成果。据我 所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发 表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体， 均已在文中作了明确说明并表示了谢意。 作者签名：妄压芝 日期：型呈：笪：z 垒 学位论文使用授权声明 本人授权沈阳师范大学研究生处，将本人硕士学位论文的全部或 部分内容编入有关数据库进行检索；有权保留学位论文并向国家主管 部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版，允许论文被查阅和借 阅；有权可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 保密的学位论文在解密后适用本规定。 作者签名：立因2 兰日期：型墨笪：z 丝 环渤海区域四种林蛙形态学和染色体研究 第一章引言 渤海是我国东部的一个半封闭陆表海，三面环陆，在辽宁、河北、山东、北 京、天津三省两市之间，形成于第三纪末期至第四纪的全新世。环渤海区域是指 环绕渤海的陆地地区，包括冀鲁平原、下辽河平原及其周边山区。冀鲁平原( 北 京、天津、河北平原及鲁西北平原) 北依燕山，西临太行山，南为泰山、沂蒙山 地及胶东丘陵。下辽河平原东西侧为辽东山地丘陵和辽西山地，北为低山丘陵。 环渤海区域属于暖温带大陆性半湿润季风气候，在动物地理区划上处于古北界东 北区的松辽平原亚区和长白山亚区以及华北区的黄淮平原亚区。由于渤海的形成 所导致的独特自然地理条件，在一些生物的分化中具有重要的地位，分布有我国 一些重要的特有生物物种，如两栖动物中的昆嵛林蛙肋刀a 觑明甩旧刀s2 s 、史氏蟾 蜍跗ds 舌咖删、东北粗皮蛙肌卯韶e 胎j a 刀d 订等( 赵尔宓等，2 0 0 4 ；陆 宇燕和李丕鹏，2 0 0 5 ) 。 林蛙( w o o df r o g ) 是一类具有背侧褶、鼓膜部位有黑色斑块、非繁殖期主要 生活于山林的棕色陆栖蛙类，因此也称为棕蛙( b r o w nf r o g ) ，分布在欧亚大陆。 这类蛙过去归属于蛙科r a n i d a e 、广义蛙属屁刀as e n s ul a t o ( 刘承钊和胡淑琴， 1 9 6 1 ：d u e l l m a n ，1 9 9 3 ) ，近来随着对蛙科系统演化和分类的研究，将其归入林 蛙属肱加( 费梁等，2 0 0 5 ； f r o s te ta 1 ，2 0 0 6 ； f r o s t ，2 0 0 7 ) 。此外，也有 学者( f r o s t ，2 0 0 7 ) 根据分子演化的研究将我国分布的趾沟蛙属的越南趾沟蛙 眙p “如馏加枷j ( 费梁等，2 0 0 5 ；1 1 4 1 1 6 页) 、拟湍蛙属的台湾拟湍蛙 p s e u d 0 锄0 i o p ss a u t e r j 和多齿拗湍蛙p m u i t i d e n t i c u l a t i s ( 费梁等，2 购5 ， 2 6 7 2 6 9 页) 、以及有争议的张村蛙忍册加鲫( 费梁等，2 0 0 5 ，2 6 7 2 6 9 页) 等归于林蛙属。 现全世界已知有林蛙3 0 余种，其中我国有2 0 种，广泛分布于我国大陆和台 湾( 费梁等，2 0 0 5 ；陆宇燕和李丕鹏，2 0 0 5 ；l ip fa 上，2 0 0 6 ；沈猷慧等，2 0 0 7 ； l up fa ，2 0 0 7 ； l i p 芒a j ， 2 0 0 8 ) 。 环渤海区域共分布有林蛙7 种。它们分属于我国所有三个林蛙种组，其中长 肢林蛙种组的镇海林蛙尼劢勘肠j 鲫s 拈和新近发表的徂徕林蛙尼c ，a j 鲫s ，s 分别间断性的分布于山东泰山和天津与河北北部交界处区域；中国林蛙种组的东 北林蛙尼劬d 胚材j 和中国林蛙尼动即s 砌鲫s 拈都是广布种，其中东北林蛙分 布于辽宁东部和西部，中国林蛙除分布于河北西部和北部以及北京的丘陵和山区， 在山东主要分布于山东半岛崂山；黑龙江林蛙种组的桓仁林蛙尼觑，a n 阳疗鲫s 拈 和昆嵛林蛙见脚鲫s j s 分别分布于辽宁东部和山东半岛昆嵛山，黑龙江林蛙 环渤海区域四种林蛙形态学和染色体研究 尼a 舰，阳疗s 括分布于辽宁北部彰武( 费梁等，2 0 0 5 ；沈猷慧等，2 0 0 7 ；l ip fa 上， 2 0 0 6 ；l ie a j ， 2 0 0 8 ) 。 一研究概况 我国林蛙种群的研究起始于1 9 世纪中叶，p o p e 和b o r i n g 将中国的林蛙简单地 归为两种一北方的中国林蛙和南方的日本林蛙。1 9 6 1 年，经我国著名两栖动物学 家刘承钊和胡淑琴的深入研究，依据地理分布和外部形态，将我国林蛙分为南方 种组和北方种组。2 0 0 5 年费梁等提出新的种组划分，将北方种组分为中国林蛙种 组( 肱船动e 船j j r 7 鲫s j ss p e c i e sg r o u p ) 和黑龙江林蛙种组( 毖加a 艘，阳疗s j s s p e c i e sg r o u p ) ，将北方种组中没有内声囊的物种划分出来，归入黑龙江林蛙种 组，包括黑龙江林蛙尼a 胱z 阳刀s 括、阿尔泰林蛙尼a j a j c a 、桓仁林蛙尼 觑，a 忍阳，7 鲫酊刚昆嵛林蛙尼咖咖拈；南方种组归入长肢林蛙种组( 肋册 c 删c r z ，ss p e c i e sg r o u p ) 。 2 0 世纪8 0 年代以来，随着细胞遗传学、生物化学等研究技术和手段在分类学 上的应用，国内、外学者对不同地区中国林蛙和其他林蛙在形态学、生态学、细 胞学以及胚胎发育等方面开展了丰富的研究工作，并探讨了系统发育及物种形成 与分化( 吴政安，1 9 8 1 ，1 9 8 2 ：吴政安和殷建文，1 9 8 3 ；魏刚等，1 9 9 1 ，1 9 9 4 ，2 0 0 4 ： 赵元藩，1 9 9 4 ：曾晓茂等，1 9 9 8 ；邵永平等，1 9 9 9 ；钱晓薇和朱睦元，2 0 0 0 ；曾 科文等，2 0 0 l ；江建平等，2 0 0 2 ；潘晓赋等，2 0 0 2 ；夏玉国等，2 0 0 6 ；李树深， 2 0 0 6 ) 。根据核型的情况可把我国的林蛙分成两大类，一类为2 n = 2 4 ，主要包括中 国林蛙种组，另一类是2 n = 2 6 ，包括黑龙江林蛙种组和长肢林蛙种组。 近1 0 年来，从系统学和保护生物学的角度对林蛙的研究，主要包括二方面。一 方面继续从经典分类学的角度研究我国生物物种的多样性，包括成体和蝌蚪的外 部形态研究( 谢锋等，1 9 9 5 ，1 9 9 9 ，2 0 0 0 ；陆宇燕等，2 0 0 2 ；王晶琦等，2 0 0 6 ； 沈猷慧等，2 0 0 7 ；l up a j ，2 0 0 7 ；l ip 手a 上，2 0 0 8 ) ，最近一年来先后发表 了寒露林蛙尼施刀，j c a 、猫儿山林蛙尼嬲d 已rs ：加仃鲫s j 薪口徂徕林蛙 尼c 以a j 鲫s 拈( 沈猷慧等，2 0 0 7 ；l up 芒a - ，2 0 0 7 ： l ip fa 上，2 0 0 8 ) ；另 一方面，就是从分子水平探讨物种起源分化和种群遗传多样性。分子演化研究在 明确了这些物种的系统发育关系基础上，也进一步对一些种的分类和种组的划分 提出疑议和修正( t a n a k a ，p a j ，1 9 9 6 ，t a n a k a u e n o ，e 亡a j ，1 9 9 8 ：m a t s u i ， p 芒a - ，2 0 0 1 ；江建平和周开亚，2 0 0 1 ；杨学干等，2 0 0 1 ；k i 血，e 芒a ，2 0 0 2 ； 车静，2 0 0 5 ；n g o ，e 芒a j ，2 0 0 6 ；j i a n ga n dz h o u ，2 0 0 6 ；s o n g ，e 芒a 上，2 0 0 6 ； c h ep 芒a 上，2 0 0 7 ) 。其中，如前所述，将趾越南趾沟蛙、台湾拟湍蛙、多齿拟 2 环渤海区域四种林蛙形态学和染色体研究 湍蛙和张村蛙归于林蛙属。 二研究内容 在整理总结我国林蛙分类和地理分布的基础上，以分布于环渤海区域的四种 林蛙一昆嵛林蛙、崂山中国林蛙、桓仁林蛙和东北林蛙为研究对象，对这四种林 蛙蝌蚪和成体进行外部形态、骨骼、染色体比较分析，以探讨该区域林蛙之间的 共性、差异和亲缘关系。本文对环渤海区域四种林蛙的研究主要包括三个方面， 林蛙蝌蚪外部形态研究，成体外部形态及骨骼系统的研究，染色体核型及银染的 研究。 ( 一) 林蛙蝌蚪的外部形态研究 林蛙蝌蚪的外部形态特征与其生活环境密切相关，蝌蚪外部形态的研究对林 蛙多样性研究是一很好的补充。采用国内外对无尾两栖类蝌蚪形态研究常用的标 准及方法，对四种林蛙蝌蚪( 福尔马林固定标本) 进行外部形态观察，包括体型、 体色等；对具有鉴别意义的外部特征，例如唇齿式，进行详细描述和比较；以及 对一些重要的形态学量度，包括全长、体长、尾长、后肢长等进行测量，运用 s p s s 数据统计分析软件对所得数据进行统计分析，探讨其结构特征与其栖息地 之间的适应关系。 林蛙形态学研究 林蛙成体在外部形态方面既具有相似性又具有一定的差异。依据经典的形态 学研究标准及方法，对四种林蛙成体外部形态观察，包括体型、体色、斑纹的分 布、疣粒的大小、多少等；对重要的外部结构特征的描述比较，例如雄性个体婚 垫的位置，大小等；对某些形态学量度进行测量，包括体长、头长、头宽、鼻间 距、眼间距等。 运用无尾两栖类双色透明骨骼标本的制作方法获得四种林蛙的骨骼标本，对 林蛙的骨骼系统的各骨块进行观察和描述，包括骨块的形状，数量，相对位置和 连接方式等；对一些重要要的形态学量度进行测量，运用s p s s 数据统计分析软 件对所得数据进行统计分析。探讨林蛙外部形态与栖息地之间的适应关系，进行 种问比较并得出它们之间的共性、差异确定它们在进化中亲缘关系。 林蛙染色体研究 染色体是物种的遗传学基础，对四种林蛙染色体的研究包括染色体核型、银 染标本的制作、观察、拍摄，同源染色体的配对、分析，包括染色体的数目，类 型、银染深染点的位置等；对染色体重要参数的测量，运用s p s s 数据统计分析 3 环渤海区域四种林蛙形态学和染色体研究 软件对所得数据进行统计分析。染色体的种间比较分析，对于确立它们的分类地 位和亲缘关系具有不可忽略的重要作用。 三研究意义 随着社会经济的高速发展，自然资源保护和生态平衡日益受到重视，随之兴 起的生物多样性和保护生物学成为当今生物学的重要研究领域。物种多样性( 生 物分类) 的研究是保护生物学以及相关基础和应用生物学研究的重要基础。由于 全球生物多样性出现了极显著的衰减，对物种分类学研究提出了更加急迫的要 求。 林蛙是我国一类重要和复杂的蛙亚科动物，其分类存在较多的问题和争论 ( 刘承钊等，1 9 6 l ；谢锋等1 9 9 5 ，1 9 9 9 ，2 0 0 0 ；江建平等，2 0 0 1 ；杨学干等， 2 0 0 1 ) ，近年来的分子演化研究也对个别物种的有效性和系统关系提出了新的疑 问，这些问题均需要从分类的角度进一步深入研究探讨。 因此，从经典分类的角度，通过对林蛙成体和蝌蚪形态结构的比较和形态性 状的多变量统计分析，系统全面地了解这类物种在形态结构、染色体及蝌蚪等方 面的特征及关系，有助于全面系统地掌握我国林蛙资源现状和生物多样性特点。 对于澄清近年来对这一物种争议颇多的分类问题有重要的科学意义，对珍稀特有 物种的保护生物学研究及林蛙产业的开发提供重要的基础数据和资料。同时，在 探讨分子演化与形态结构之间，在进化与适应，以及台湾和海南等岛屿与我国大 陆这一类物种的起源和分化等关系方面具有重要的现实意义和学术价值。 环渤海区域是我国林蛙分布最为丰富和多样性最高的地区，是林蛙多样性的 热点地区也是我国林蛙类群的一个分化中心( 陆宇燕和李丕鹏，2 0 0 4 ) 。这与环 渤海的形成以及自然地理变迁有着不可密切的关系，探讨他们之间的系统演化关 系、起源和分化趋势对认识我国林蛙有着重要的意义( 陆宇燕和李丕鹏，2 0 0 4 ) 。 环渤海区域的四种林蛙昆嵛林蛙、中国林蛙、桓仁林蛙和东北林蛙，无 论是从物种多样性上还是从细胞遗传以及生态上都表现出复杂的生物多样性。昆 嵛林蛙是陆宇燕和李丕鹏( 2 0 0 2 ) 在山东昆嵛山发现的一新种，它不仅是我国的 特有物种，而且种群较小，分布范围狭窄，探讨其与其他林蛙的发展演化关系对 于更科学地保护这一宝贵的林蛙资源具有重要的指导意义。桓仁林蛙是刘明玉等 ( 1 9 9 3 ) 在辽宁省桓仁县发现的一新种，分布于我国辽东地区，陆宇燕等( 2 0 0 5 ) 发现其在长白山也有分布。虽然桓仁林蛙具有黑龙江林蛙种组背侧褶弯曲和无内 声囊的特点，但在分子演化方面其与不同居群的中国林蛙为姊妹关系，并对其有 效性提出质疑( 车静等，2 0 0 5 ；c h ep 芒a ，2 0 0 7 ) 。对于桓仁林蛙的研究，对 4 环渤海区域四种林蛙形态学和染色体研究 于确立其有效性及其在整个环渤海区域林蛙种群中的分类地位具有重要价值。 环渤海区域的广布种东北林蛙因哈士蟆油而广为人知( 张颖才，1 9 5 6 ) ， 近年来又发现其皮肤活性肽具有很高的药用价值，东北林蛙的人工养殖已成为我 国迅速发展起来的特有生物养殖产业。研究东北林蛙对于更好地可持续地利用这 一宝贵的林蛙资源具有重要意义。中国林蛙是我国的广布种和特有物种，在青岛 的分布与其他分布区呈隔离状态，并且在青岛分布区域狭窄，仅见于崂山的丘陵 山地区。青岛是中国林蛙分布的最东点，崂山产中国林蛙不仅在形态上与其他地 区的中国林蛙有一定的差别，而且前人在细胞遗传上的研究也曾提出青岛的中国 林蛙应为中国林蛙的一个亚种。 因此，研究环渤海区域这四种重要而特殊的林蛙的生物学特性，从进化的角 度分析它们之间的关系，不仅对了解我国生物分布格局和进化有着重要的意义， 而且对预测未来环境变化对物种影响和生物多样性及环境保护有重大价值。 环渤海区域四种林蛙形态学和染色体研究 第二章林蛙蝌蚪形态学研究 蝌蚪( t a d p 0 1 e ) 是无尾两栖类动物个体发育的一个特殊时期，不同种类的 个体在适应环境的过程中表现出不同的形态变化，从而体现了无尾两栖类动物多 样性的特点。大多数无尾两栖类的蝌蚪生活在水环境中的时间比繁殖的成体要长 久，因此蝌蚪比成体更易采集( m cd i a r m i d a l t i g ，1 9 9 9 ) 。蝌蚪的外部形态 和口部结构特征具有相对稳定的科、属、种间特点，并与生活的环境有着密切的 关系。研究蝌蚪的形态特征及口部特点，对无尾两栖类动物的分类具有辅助作用， 尤其对科、属、种的鉴别提供重要依据。同时，蝌蚪样品也成为一种简洁有效的 评估无尾两栖动物生物多样性、种群动态和环境监测的方法，掌握不同无尾两栖 动物蝌蚪的特征，在这几个方面具有重要的现实意义。 长期以来，对蝌蚪的研究没有像对成体那样受到两栖动物学者的重视，至今 大约只有三分之一物种的蝌蚪被描述，有关蝌蚪的参考资料、检索表和种内变异 的数据比较缺乏，急需对一些物种的蝌蚪进行观察和描述( n o 叫r a ，p fa 上， 2 0 0 3 ) 。除蝌蚪的外部形态等特征外，其唇乳突和唇齿式也是非常重要的鉴别指 标。 对蝌蚪的研究可以追溯到1 9 世纪后半叶，l a t a s t e ( 1 8 7 9 ) 首先将蝌蚪的形 态特征试用于无尾两栖类的分类学研究中。0 r t o n ( 1 9 5 3 ，1 9 5 7 ) 根据蝌蚪口的 外部形态特征和出水孔的位置，将无尾类各科归纳为4 个类群( 总科) 。尽管 s t a r r e t t ( 1 9 7 3 ) 与s o k 0 1 和o r t o n ( 1 9 7 5 ，1 9 7 7 ) 在解释蝌蚪的一些形态特征 所包含的系统关系上存在一些争议，但是w a s s e r s u g ( 1 9 8 0 ) 和i n g e r ( 1 9 8 3 ，1 9 8 5 ) 关于蝌蚪口腔内部形态特征的论著，揭示了无尾类蝌蚪口咽腔形态结构在不同类 群、属和种问存在差异，具有显著的分类学和生态学意义，为澄清无尾类的一些 分类学问题开辟了新的途径。国际上一些国家和政府机构随着网络化时代的到 来，建立了蝌蚪鉴定与环境监测的专门网站，出版了相应的专著。 国内对蝌蚪的分类学研究也有一定基础，国际著名两栖动物学家刘承钊在二 十世纪上半叶就开展了蝌蚪的外部形态特征研究( l i u ，1 9 4 0 ) 。而后，一些学者 对蝌蚪的口部特征开始研究，我国动物学创始人之一李汝祺教授指导学生江先群 ( 1 9 5 8 ) 对我国3 5 种蝌蚪的“味觉器 进行深入系统的研究。此后，我国学者将 蝌蚪作为无尾两栖动物分类和环境监测等发面的一个重要的研究内容。其中台湾 周文豪等对台湾地区无尾两栖类蝌蚪口腔内部结构进行观察和详细的描述，出版 了专著( c h o ua n dl i n ，1 9 9 7 ) ；李丕鹏和陆宇燕等( 2 0 0 2 ，2 0 0 6 ，2 0 0 7 ，2 0 0 8 ) 等对昆嵛林蛙蝌蚪的生长发育和口腔内部结构等进行了研究，并从蝌蚪方面进一 步明确了凹耳蛙和宁陕齿突蟾等的分类地位，为我国开展无尾两栖动物蝌蚪分 6 环渤海区域四种林蛙形态学和染色体研究 类、多样性与保护监测研究提供了新的思路。这些研究进一步加强了对两栖动物 生活史、个体发育与环境关系和系统发生研究的重视。 环渤海区域是我国北方生物多样性研究一个重要区域，随着环渤海经济圈的 建立，在环境保护和监测方面也将是我国一个非常重要的地区。因其特殊的自然 环境，我国2 0 种林蛙中有7 种分布于该区域，并且有桓仁林蛙和昆嵛林蛙等是 本区域的特有物种。这些物种表现出很高的多样性，但对它们的分类地位和在系 统演化中的相互关系历来争论颇多。该区域可能是林蛙的一个重要的分化中心 ( 陆宇燕和李丕鹏，2 0 0 5 ；l i ，e 芒a - ，2 0 0 8 ) ，近几年来的研究工作非常活跃。 陆宇燕等( 2 0 0 2 ) 对昆嵛林蛙和中国林蛙的蝌蚪的生长发育进行了比较分析，王 晶琦等( 2 0 0 4 ) 对桓仁林蛙和东北林蛙蝌蚪的形态进行了比较，李丕鹏等对昆嵛 林蛙蝌蚪的口器结构进行研究，并发表了徂徕林蛙新种等等( 李丕鹏等，2 0 0 8 ； l i ，p 芒a j ，2 0 0 8 ) 。从2 0 0 6 年起，我们实验室在国家自然科学基金的支持下， 开展了环渤海林蛙多样性的研究。作为硕士论文，我们选择了有代表性的四种环 渤海区林蛙一中国林蛙( 肋船动彻s 如鲫s 拈) 、昆嵛林蛙( 兄五硼弦鲫s 拈) 、桓 仁林蛙( 尼觑，a ，2 阳疗鲫s 拈) 和东北林蛙( 兄劬d 孵材j ) 作为研究对象，从分 类、多样性保护等方面进行研究，这一部分重点描述四种林蛙蝌蚪的形态特征及 口部结构进行描述。 一材料和方法 材料 收集四种林蛙3 5 3 7 期蝌蚪标本，用5 1 0 9 6 的福尔马林溶液固定。详细信 息见表1 。 表1 实验所用林蛙蝌蚪的采集时间和地点 方法 根据g o s n e r ( 1 9 6 0 ) 分期，在m o t i c 和l e i c a 研究用多功能体视显微镜下对 蝌蚪的外部形态及口部结构进行观察和照相，并用电子数显游标卡尺( 分辨率 o 0 1 唧，哈尔滨量具厂生产，产品标准号g b t 1 4 8 9 9 9 4 ) 对3 6 期蝌蚪的形态进 行测量，所得数据进行相对大小的换算和统计分析。各项量度的名称及测量标准 如下： 7 环渤海区域四种林蛙形态学和染色体研究 全长( t o t a l1 e n g t h = t o l ) ：吻端至尾末端的长度； 体长( s n o u t v e n tl e n g t h = s l v ) ：吻端至肛管基部的长度； 体宽( b o d yw i d t h = b w ) ：体两侧的最大宽度； 体高( b o d yh e i 曲t = b h ) ：体背、腹面之间的最大高度； 尾长( t a i l1 e n g t h = t l ) ：肛基部至尾末端的长度； 尾肌宽( d i 锄e t e ro ft a i l 叫s c l e = t d ) ：尾基部尾肌左右两侧的距离； 吻出水孔距( s n o u tt os p i r a c u l u l l f s s ) ：吻端至出水孔的距离； 吻肛距( s n o u tt ov e n t = s v ) ：自吻端至肛管开口的距离。 二林蛙蝌蚪的形态描述 根据四种林蛙蝌蚪唇齿式、体型、体色、尾鳍色斑、尾末端形状、出水孔位 置、肛管开口方向等特点，选择国际通用的具有代表性的发育时期( 3 5 3 7 期) 的蝌蚪进行形态学描述并照相，蝌蚪的形态特征比较总结于表2 。 昆嵛林蛙蝌蚪( 图版1 ，a c ) 体背黑灰色，腹部稍透明，隐约可见肠道，盘曲中心在体左侧，体背观，卵 圆形；上尾鳍有黑灰色色素斑点均匀分布，下尾鳍也有，但比上尾鳍分布少，尾 肌节较明显，尾肌黑灰色，偶尔也有2 、3 个黑色斑点；尾末端钝圆；出水孔位 于身体左侧靠后，游离；肛管无色透明，开口于下尾鳍右侧。 唇齿式：i ：卜1 卜1 ：i i 或i ：卜1 ，多数为前者，少数为后者，唇齿 清晰，上唇无乳突，下唇乳突两排交错排列，口两侧副乳突分布密集，乳突和副 乳突透明，无色素沉积。 桓仁林蛙蝌蚪( 图版1 ，d f ，j ) 体背黑褐色，腹面浅黑褐色，不透明，背面观椭圆形；尾鳍无斑点透明，尾 鳍相对狭长，尾肌浅灰褐色，尾肌节不明显；尾末端细长钝圆；出水孔位于身体 左侧近中央，稍游离；肛管无色透明，开口于下尾鳍右侧。 唇齿式：i ：3 3 卜l ：i 或i ：2 2 卜1 ：，所占比例分别为观察总数的 7 0 9 6 和3 0 ，唇齿部分细弱，上唇无乳突，下唇乳突口两侧副乳突少，乳突和副 乳突无色透明。 东北林蛙蝌蚪( 图版1 ，g j ) 8 环渤海区域四种林蛙形态学和染色体研究 体背部灰色，腹面透明可见肠道盘曲中心在体的左侧，背面观椭圆形；尾肌 浅灰褐色，尾肌节不明显，上尾鳍有均匀的褐色细斑点，下尾鳍无色透明，靠近 末端有少量小斑点；尾末端钝圆；出水孔位于身体左侧近中央，内壁与体壁相接 不游离；肛管无色透明，开口于下尾鳍右侧。 唇齿式为：i ：3 3 卜1 ：或i ：2 2 卜l ：，所占比例分别为观察总数 的3 3 和6 6 ，唇齿清晰，上唇无乳突，下唇两排交错排列，口两侧副乳突多而 密集，乳突和副乳突透明，下唇齿最内列断口宽，较清晰。 中国林蛙蝌蚪( 图版1 ，a - j ) 体背黑灰色，腹部浅灰色，透明，可清晰看到有规律的肠道盘曲，盘曲中心 在体左侧，体背观，椭圆形；尾鳍上有斑点，多均匀分布，下尾鳍基本无色透明， 尾末端稍有色素斑，尾肌节明显，尾肌浅灰色；尾末端钝圆；出水孔位于身体左 侧近中央，不游离；肛管无色透明，开口于下尾鳍右侧。 唇齿式为：i ：3 3 卜1 ：m ，唇齿清晰，上唇无乳突，下唇两排交错排列， 口两侧副乳突少，乳突和副乳突透明，下唇齿最内列断口窄。 表2 四种林蛙蝌蚪形态特征比较 9 环渤海区域四种林蛙形态学和染色体研究 四种林蛙蝌蚪检索表 1 上唇齿2 排，唇齿式为i ：卜1 卜1 ：i i 或i ：卜1 ”昆嵛林蛙兄缸碾雕旧门s j 上唇齿3 排或四排，唇齿式为i ：3 3 卜1 ：或i ：2 2 卜1 ： “一2 2 腹部不透明，看不清肠道，流水中生活桓仁林蛙尼力凇肘鲫鲫s 拈 腹部透明，清晰可见肠道，静水中生活3 3 口两侧副乳突多，下唇齿最内列断口大而明显东北林蛙尼啪d 孵艇f 口两侧副乳突少，下唇齿最内列断口小不明显中国林蛙尼动印s j ，7 哪拈 三林蛙蝌蚪测量 对3 6 期蝌蚪形态进行测量，测量结果见表3 ： 表3 四种林蛙蝌蚪的部分形态测量值单位( m m ) 由数据可以明确看出这几种林蛙的体型大小，最大的是中国林蛙蝌蚪，全长 1 0 环渤海区域四种林蛙形态学和染色体研究 为3 8 8 9 咖，其次是东北林蛙蝌蚪和昆嵛林蛙蝌蚪，全长分别为2 8 8 6 咖和 2 7 5 5 舳，最小的是桓仁林蛙蝌蚪，全长为2 3 9 1 砌，由此进一步肯定了上面的 结论。由于生存环境的不同，食物的供给不同，它们之间的体形很可能会有差异。 为了减少客观物质方面的差异，将各个测量值均与各自的体长进行比较，比较结 果如表4 ： 表4 四种林蛙蝌蚪相对大小比较( 体长) 3 5 0 3 0 0 2 5 0 璺2 o o 3 n 1 5 0 1 o o o 5 0 o o o 01234567 8 图1四种林蛙蝌蚪部分形态量度与体长的比例关系 昆嵛林蛙3 6 期 崂山中国林蛙3 6 期 桓仁林蛙3 6 期 东北林蛙3 6 期 说明：1 为全长体长，2 为体宽体长，3 为体高体长，4 为尾长体长，5 为尾肌宽体长 6 为吻出水孔距体长，7 为吻肛距体长 四讨论 无尾两栖类蝌蚪的外部形态和口部结构特征具有相对稳定的科、属、种内特 点，并与生活的环境有着密切的关系。o r t o n ( 1 9 5 3 、1 9 5 7 ) 根据蝌蚪的外部形 态和口部结构特点将蝌蚪分为4 种类型。通过对4 种林蛙蝌蚪的观察，结果不仅 ： 一 环渤海区域四种林蛙形态学和染色体研究 表明它们与林蛙其它物种和趾沟蛙属等的蝌蚪( 费梁等，2 0 0 5 ) 相似，属于静水 型或流溪型，o r t o ni v 型( 0 r t o n ，1 9 5 3 ：d u e l l n l a na n dt r u e b ，1 9 9 4 ) ；并且进 一步说明这一类群物种蝌蚪在外部形态和口部结构方面的稳定性更大。其共同特 点是具有唇乳头，角质化的唇齿，唇齿列数较少，上唇2 4 列，下唇3 4 列，上 唇最外一列左右连续，下唇外三列左右连续。 从这四种林蛙蝌蚪在3 6 期外部形态特征来看，体型最大的是山东省青岛市 崂山的中国林蛙蝌蚪，其次是辽宁省桓仁县老秃顶子的东北林蛙蝌蚪和山东省文 登市昆嵛山的昆嵛林蛙蝌蚪，体型最小的是辽宁省桓仁县老秃顶子的桓仁林蛙蝌 蚪。尽管它们的体背部颜色都为黑褐色，但腹部颜色有所区别，中国林蛙、东北 林蛙、昆嵛林蛙的蝌蚪腹部透明，可清晰见肠道有规则的盘曲，盘曲中心在身体 的左侧，但桓仁林蛙腹部不透明，浅黑褐色，看不清楚肠道。此外，具有鉴别特 征的指标包括下面几点：昆嵛林蛙蝌蚪的唇齿式为i ：卜l 卜l ：i i 或i ：卜l ，上唇2 列，外列连续，内列中间断开，下唇3 列，有时最内列中间断开。 而中国林蛙和东北林蛙蝌蚪的唇齿式上下唇都为4 列。但根据对中国林蛙和昆嵛 林蛙蝌蚪的研究( 陆宇燕等，2 0 0 2 ) ，中国林蛙和东北林蛙蝌蚪唇齿式的出现和 形成在生长发育过程中可能存在差异，而且唇齿的长短大小也有所不同，表现出 种间差异。 由图l 和图版1 ( a - j ) 可以看出昆嵛林蛙蝌蚪与其它三种林蛙蝌蚪在形态 大小上存在显著差异。中国林蛙、桓仁林蛙、东北林蛙蝌蚪各相对数值相近，差 异较小。昆嵛林蛙蝌蚪全长为体长的2 9 8 倍，尾长为体长的1 9 8 倍，大于其它 三种林蛙蝌蚪的数值，说明昆嵛林蛙蝌蚪在尾长方面大于其它三种林蛙蝌蚪，但 在尾肌方面没有其它三种林蛙蝌蚪尾肌发达；昆嵛林蛙蝌蚪吻出水孔距是体长的 8 1 ，中国林蛙蝌蚪吻出水孔距是体长的6 3 ，桓仁林蛙蝌蚪吻出水孔是体长的 6 5 ，东北林蛙蝌蚪吻出水孔距是体长的6 9 ，说明昆嵛林蛙蝌蚪出水孔位置靠 体后，而其它三种靠近体侧中央；昆嵛林蛙蝌蚪吻肛距为体长的1 2 2 倍，中国 林蛙蝌蚪吻肛距为体长的1 1 2 倍，桓仁林蛙蝌蚪吻肛距为体长的1 1 2 倍，东北 林蛙蝌蚪吻肛距为体长的1 1 3 倍，这说明昆嵛林蛙的肛管比其它三种林蛙蝌蚪 的要长。 大约有四分之三的无尾两栖动物在其发育的一定阶段都有蝌蚪这一特殊发 育时期。对大多数这类物种来说，蝌蚪分布于水环境中的时间远长于繁殖期的成 体，其比成体更容易采集( m cd i a r m i d a l t i g ，1 9 9 9 ) 。因此，蝌蚪样品也成 为一种简洁有效的评估无尾两栖动物生物多样性的方法，但同时也需要对蝌蚪 有合适的鉴定方法。除蝌蚪的外部形态等特征外，其唇乳突和唇齿式也是非常重 要的鉴别指标( 李丕鹏，2 0 0 6 ) 。 1 2 环渤海区域四种林蛙形态学和染色体研究 综上所述，根据外部形态和口部特征可以很明显的可以鉴别出这四种林蛙蝌 蚪及其成体的分布地。不仅如此，它们在生活史方面也有不同，昆嵛林蛙、中国 林蛙，东北林蛙蝌蚪生活于水塘、水潭或水流迟缓的溪流等静水区，而桓仁林蛙 产卵子水流较大的河流中，蝌蚪生活在其中( 刘明玉等，2 0 0 5 ) ，前三者蝌蚪的 上下尾鳍比桓仁林蛙蝌蚪的大，适合在静水中生活，所以说，昆嵛林蛙、中国林 蛙、东北林蛙三种蝌蚪属静水型，桓仁林蛙属流水型。此外，这四种蛙的产卵时 间也有区别，桓仁林蛙和东北林蛙4 月末5 月初产卵，昆嵛林蛙2 4 月初产卵， 崂山中国林蛙2 5 月初产卵；而且东北林蛙、中国林蛙、昆嵛林蛙产卵后卵团 浮于水面，而桓仁林蛙产卵后，卵团黏附于水底石头上，这些都为野外调查林蛙 分布，蝌蚪鉴定、种群动态和环境变化监测提供一些科学依据。 图版1 ：