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改良组织块法培养人肺成纤维细胞及其形态学观察【摘要】 原代培养； 成纤维细胞； 组织块法； 免疫细胞化学； 波形蛋白 【关键词】 原代培养； 成纤维细胞； 组织块法； 免疫细胞化学； 波形蛋白原代培养作为获取细胞的主要途径已成为科学研究的重要组成部分。过去人们通常采用酶消化法、差速离心法和贴壁法等方法，但结果都不大理想。例如酶消化法步骤繁多，且受多种因素影响，条件不易控制，所以统一推广比较困难。笔者在查阅文献的基础上，结合实践操作摸索出一套人肺成纤维细胞原代培养方法改良组织块培养法，该方法简单易于操作，且省掉了中间大部分步骤，可有效降低污染的发生，其缺陷是获取第一代原代细胞时间相对较长。现报告如下：1 材料和方法1.1 材 料 倒置相差显微镜为德国徕卡仪器有限公司生产。NAPCO1-800-621-8820水套式二氧化碳恒温孵育箱是法国JOUAN公司产品。Sanford Maines SG403CE生物安全柜、FBS、RPMI1640为美国Gibco公司产品。磷酸盐缓冲液由本实验室配制。青霉素、链霉素产自华北制药股份公司。25 ml细胞培养瓶为Greiner Bio-One GmbH公司产品。I型胶原酶为南京生兴公司产品。鼠抗人波形蛋白（vimentin）抗体、S-P超敏试剂盒及DAB显色试剂盒均购自福州迈新生物技术有限公司。肺组织标本由南京军区第八一医院提供。 1.2 原代肺成纤维细胞的培养 切取手术患者肺部远离肿瘤组织的正常肺组织，立即置于放有M199培养基的无菌瓶中，带回超净台处理。把组织摊开，反复用PBS清洗，尽量去除组织块上附着的血污和其他杂质，至溶液清亮透明为止。用镊子去除血管等附属物，仔细去净，再冲洗数次，至溶液清亮，移至培养皿中。用眼科剪剪碎组织块（大约5 min），用弯头镊子将组织块贴在瓶壁上。组织块放好后，将贴组织块一侧朝上向瓶内加入2 ml含10ûS的RPMI1640培养基，倒置放入37培养箱中。培养瓶过夜后轻轻翻正，并向瓶内补加少许培养基，静止培养。以后34 d换1次液，7 d内不要轻易动瓶，保持培养瓶静止。7 d后观察，有成纤维细胞游出并能顺利传代者视为培养成功。1.3 细胞鉴定 将培养的第六代细胞，接种到放有盖玻片的培养皿中，细胞贴盖片生长。吸干培养液，经甲醛室温固定30 min，晾干。按S-P法标准程序进行操作。内源性过氧化物酶阻断剂阻断其干扰，正常山羊非免疫血清封闭。 滴加一抗波形蛋白单克隆抗体孵育，加生物素标记羊抗鼠IgG，滴加链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶工作液，DAB 室温镜下观察显色效果，苏木素复染，脱水透明，中性树胶封片，光镜下观察。2 结果2.1 原代培养观察 组织块贴壁3 d后，有活性的肺组织块能紧密贴壁。倒置显微镜下观察组织块透光性差，呈现为暗黑色遮光区域，组织小块接种后最快在第4天可见周围有单个细胞游出。其胞体较大，细胞界限清楚，立体感强，折光率高，以梭形为主，也可见到不规则三角形、多角形等各种形状的细胞，并彼此连接成网状。随后组织块周围细胞逐渐密集，胰酶消化使细胞均匀布满瓶壁。达到一定密度后，细胞生长进入对数期，分裂迅速，有伪足样突起，完全伸展的细胞呈扁平长梭形，核周轮廓不清。细胞密度较低时，相互交织呈网状，密度较高时细胞融合呈束状。成纤维细胞逐渐生长融合成片。11 d左右细胞高度融合即可传代。 2.2 免疫细胞化学染色 见图1a，中间丝波形蛋白阳性，棕黄色颗粒定位于胞质，说明细胞表达波形蛋白。a： 肺成纤维细胞阳性b：阴性对照（PBS代替抗中丝蛋白抗体）图1 中间丝波形蛋白免疫组化染色结果（略）Fig 1 Staining of vimentin 3 讨论 成纤维细胞是结缔组织的主要构成细胞，其基本功能是合成和分泌胶原蛋白、弹性蛋白、糖蛋白等多种重要的细胞外成分和细胞因子。胚胎成纤维细胞还可以诱导为成骨细胞等，对临床意义重大。原代培养常采用组织块法和酶消化法。酶消化法步骤多，过程复杂，影响因素较多，成功率很低。并且酶本身对细胞贴壁有很大影响1，离心也会使细胞损伤和丢失2。而要防止胰酶对细胞的继续损伤，细胞接种悬液中应尽量将其去除3，故不宜采用。组织块培养法相对酶消化法步骤简单，容易掌握，操作过程中不易发生污染4。组织块法成活率高，简单易行5,6。本实验采用改良组织块自然贴壁法4，经过适者生存的选择，其中有活性的组织块自然贴壁，同时，最大限度地保留了组织中各种生长因子的活性，保留了其对细胞增殖的促进作用7。组织块中含有大量的生长因子，通过剪切，可以使这些生长因子游离出来释放到培养基中，对细胞的体外生长起积极作用。 本培养方法不需要任何分离细胞的物理及化学方法，避免了对细胞的损伤。用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养的成纤维细胞绝大多数呈梭形，胞体细长，细胞透明度大，折光性强，具有成纤维细胞的形态学特征。 成纤维细胞的鉴定指标有多种，包括中间丝波形蛋白或脯氨酰4-羟化酶亚单位( Prolyl 4-hydroxylase)8。我们采用免疫细胞化学方法检测其是否表达中间丝波形蛋白。波形蛋白丝是中间纤维的一种，存在于间质细胞和中胚层来源的细胞中，是鉴定成纤维细胞的一个很好的指标。我们培养的细胞抗波形蛋白抗体阳性，结合取材及细胞形态学特点，表明其为成纤维细胞。 采用这种方法，我们作了4次培养，第3天有细胞游出的1次，其余均为第4天观察到细胞。4次培养的细胞都能够顺利传代，已经传到第11代，细胞生长状况良好。每一代都有细胞冻存保种。复苏的细胞生长状况良好。4次培养无1次污染。 【参考文献】 1 周海文，周曾同，商庆新，等.体外连续培养人口腔粘膜角化细胞J.中华口腔医学杂志，2000，35(6)：455-457.2 周曾同，黄吉燕，周晓健.人口腔粘膜异常增生上皮细胞体外培养体系的研究J.临床口腔医学杂志，2003，19(9)：520-523.3 司徒镇强，吴军正.细胞培养M.西安：世界图书出版公司西安公司，1996：1，55-210，206-210.4 任 娟，李 霞，孙克勤，等.人牙周膜成纤维细胞的原代培养及鉴定J.中国口腔杂志，2007，7（9）：672-673. 5 Oda D,Savard CE,Eng L,et al.Reconstituted human oral and esophageal mucosa in cutureJ.In Vitro Cell Dev Biol Anim,1998,34（1）:46-52.6 Chang SE,Fosler S,Beess D,et al.Cultured gingival epitheliumJ.J Cranio Max Fac Surg,1991, 19（1）:21-26 7 王 英，