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第三章 酶与辅酶,生物体内的新陈代谢是一切生命活动的基础。新陈代谢是由无数的复杂的化学反应组成的，这些化学反应几乎都是在特异的生物催化剂-酶的驱动下进行的。没有酶就没有生命。 定义：酶是由活细胞产生的，具有催化功能的生物大分子物质，其化学本质绝大部分为蛋白质，少数为核酸（核酶、脱氧核酶）。,第一节 酶生物催化剂,酶学研究简史,公元前两千多年，我国已有酿酒记载。 一百余年前，Pasteur认为发酵是酵母细胞生命活动的结果。 1878年，Kuhne首次提出Enzyme一词。 1897年，Buchner兄弟用不含细胞的酵母提取液，实现了发酵。 1926年，Sumner首次从刀豆中提纯出脲酶结晶。证实酶的蛋白质本质，获1946年诺贝尔奖。 1982年，Cech首次发现RNA也具有酶的催化活性，提出核酶(ribozyme)的概念。Cech等获得1989年诺贝尔化学奖。 1995年，Jack W.Szostak研究室首先报道了具有DNA连接酶活性DNA片段，称为脱氧核酶(deoxyribozyme)。,二、酶的催化特点 (一) 酶与一般催化剂的共性 1本身反应前后无变化 酶与一般催化剂一样，在化学反应前后都没有质和量的改变。 2不改变化学反应平衡常数 酶只催化热力学允许的化学反应，只能加速可逆反应的进程，而不改变反应的平衡点，作用是缩短反应达到平衡所需的时间。 3降低反应的活化能 活化能指的是在一定条件下，能使l摩尔底物全部进入活化态所需要的自由能(卡摩尔)。,活化能：底物分子从初态转变到活化态所需的能量。,（二）酶的催化特性 1.反应条件温和 常温、常压、 pH近中性的水溶液酶易失活 2.高度的催化效率 酶催化效率比非催化反应高108 1020倍；比一般催化剂高107 1013倍。 如：碳酸酐酶，每微摩尔每秒钟6105微摩尔底物。,3.高度专一性 作为一种生物催化剂，酶对其作用的底物有一定的要求，即一种酶只作用于一种或一类特定的底物。酶的专一性分为两大类：结构专一性和立体异构专一性 绝对专一性(absolute specificity)：只能作用于一种 特定结构的底物，进行一种专一的反应，生成一种特定结构的产物。如：脲酶：只催化水解尿素 相对专一性(relative specificity)：作用于一类化合物或一种化学键。它可分为键专一性和基团专一性两种。如酯酶 水解酯键。如-D-葡萄糖苷酶，不仅要求水解-糖苷键，且-糖苷键的一端必须是葡萄糖，所以可水解蔗糖、麦芽糖。 立体结构特异性(stereo specificity)：作用于立 体异构体中的一种。,乳酸脱氢酶的底物和酶的三点附着（tree-point attachment）理论。D(-)乳酸由于-OH、 -COOH的 位置正好相反，因此造成与酶的的三个基团不能完成结合，故而不能受酶的催化。,4酶的催化活性的可调节性 酶促反应受多种因素的调控，以适应机体对不断变化的内外环境和生命活动的需要。其中包括三方面的调节。 对酶生成与降解量的调节 酶催化效力的调节 通过改变底物浓度对酶进行调节等,三、 酶的分类 1.根据组成成分,辅助因子分类 （按其与酶蛋白结合的紧密程度）,辅酶 (coenzyme): 与酶蛋白结合疏松，可用透析或超滤的方法除去。,辅基 (prosthetic group): 与酶蛋白结合紧密，不能用透析或超滤的方法除去。,金属离子的作用 稳定酶的构象； 参与催化反应，传递电子； 在酶与底物间起桥梁作用； 中和阴离子，降低反应中的静电斥力等。,小分子有机化合物的作用 在反应中起运载体的作用，传递电子、质子或其它基团。主要为水溶性的B族维生素参与组成。,小分子有机化合物在催化中的作用,结合酶的特点： 1、只有全酶才有活性。 2、一种酶只能有一种辅酶或辅基;不同的酶可有相同的辅酶或辅基： 如乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、柠檬酸脱氢酶均以 NAD+ 作为辅酶。 3、全酶中的辅酶决定了酶所催化的类型与性质（反应专一性），而酶蛋白决定了所催化的底物类型（底物专一性）。,酶的分类 2.根据的分子结构,单体酶(monomeric enzyme)：仅具有三级结构的酶。 牛胰RNase 124a.a 单链 鸡卵清溶菌酶 129a.a 单链 胰凝乳蛋白酶 三条肽链 寡聚酶(oligomeric enzyme)：由多个相同或不同亚基以非共价键连接组成的酶。 含相同亚基的寡聚酶： 苹果酸脱氢酶（鼠肝），2个相同的亚基 含不同亚基的寡聚酶： 琥珀酸脱氢酶（牛心），2个亚基 绝大多数寡聚酶都含有偶数亚基，但个别含奇数个亚基，如荧光素酶含3个亚基。亚基之间靠次级键结合。,酶的分类根据的分子结构,多酶体系(multienzyme system)：由几种不同功能的酶彼此聚合形成的多酶复合物。 大肠杆菌丙酮酸脱氢酶复合体由三种酶组成： 丙酮酸脱氢酶（E1） 以二聚体存在 29600 二氢硫辛酸转乙酰基酶（E2） 70000 二氢硫辛酸脱氢酶（E3） 以二聚体存在 256000 12个E1 二聚体 2496000 24个E2 单体 2470000 6个E3 二聚体 1256000 总分子量：560万,酶的分类 3.根据的反应类型,氧化-还原酶催化氧化-还原反应。 主要包括脱氢酶(dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)。 如，乳酸(Lactate)脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。,(1) 氧化-还原酶,转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。,(2) 转移酶 Transferase,常见的有氨基转移酶、甲基转移酶、酰基转移酶、醛基转移酶及磷酸化酶。,水解酶催化底物的加水分解反应。 主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及酯酶等。 例如，脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反应：,(3) 水解酶 hydrolase,裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子形成双键的反应及其逆反应。 主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。 例如， 延胡索酸水合酶催化的反应。,(4) 裂解酶 Lyase（裂合酶）,异构酶催化各种同分异构体的相互转化，即底物分子内基团或原子的重排过程。 例如，6-磷酸葡萄糖异构酶催化生成6-磷酸果糖。,(5) 异构酶 Isomerase,合成酶，又称为连接酶，能够催化C-C、C-O、C-N 以及C-S 键的形成反应。这类反应必须与ATP分解反应相互偶联。 A + B + ATP + H-O-H =A B + ADP +Pi 例如，丙酮酸羧化酶催化的反应。 丙酮酸 + CO2 草酰乙酸,(6) 合成酶 Ligase or Synthetase,1,根据其催化底物来命名；如淀粉酶、蛋白酶 2,根据所催化反应的性质来命名；水解酶、脱氢酶 3,结合上述两个原则来命名，如琥珀酸脱氢酶 4,有时在这些命名基础上加上酶的来源或其它特点。如牛胰核糖核酸酶,四、酶的命名,1.习惯命名法,系统名称包括底物名称、构型、反应性质，最后加一个酶字。 习惯名称：己糖激酶 系统名称：ATP :葡萄糖磷酸转运酶 习惯名称:谷丙转氨酶 系统名称:丙氨酸：-酮戊二酸氨基转移酶 酶催化的反应: 谷氨酸 + 丙酮酸 -酮戊二酸 + 丙氨酸 酶分类号：（EC 2.7.1.1） 每一种酶用一个系统名称和一个酶分类号表示。,2. 国际系统命名法, 国际系统分类法及编号（EC编号） （1）按反应性质分六大类，用1、2、3、4、5、6表示。 （2）根据底物中被作用的基团或键的特点，将每一大类分为若干个亚类，编号用1、2、3 。 （3）每个亚类又可分为若干个亚一亚类，用编号1、2、3表示。 每一个酶的编号由4个数字组成，中间以“”隔开。 第一个数字表示大类，第二个数字表示亚类，第三个表示亚-亚类，第四个数字表示在亚-亚中的编号。,乙醇脱氢酶EC1.1.1.1 ， 乳酸脱氢酶EC1.1.1.27 ， 苹果酸脱氢酶EC1.1.1.37 第一个数字表示大类： 氧化还原 第二个数字表示反应基团：醇基 第三个数字表示电子受体：NAD+或NADP+ 第四个数字表示此酶底物：乙醇，乳酸，苹果酸。,第二节 酶的作用机理,酶的活性中心,一、酶的活性中心,酶分子上具有一定空间构象的部位，该部位直接与底物结合，并参与将底物转变为产物的反应过程，这一部位就称为酶的活性中心。,活性中心从功能上可分为结合部位和催化部位。 结合部位(Binding site)：酶分子中与底物结合的部位或区域一般称为结合部位。,催化部位(Catalytic site): 酶分子中促使底物发生化学变化的部位称为催化部位。 通常将酶的结合部位和催化部位总称为酶的活性部位或活性中心。 结合部位决定酶的专一性， 催化部位决定酶所催化反应的性质。,酶分子中存在的各种化学基团并不一定都与酶的活性有关。其中那些与酶的活性密切相关的基团做酶的必需基团(essential group)。,结合基团 活性中心内必需基团 催化基团 活性中心外必需基团,主要包括： 亲核性基团：丝氨酸的羟基，半胱氨酸的巯基和组氨酸的咪唑基。,酶活性中心的必需基团,酸碱性基团：门冬氨酸和谷氨酸的羧基，赖氨酸的氨基，酪氨酸的酚羟基等。,(1)活性中心只占酶的一小部分。 (2)酶活性中心是酶分子中具有三维结构的区域，形成活性中心的氨基酸可能在一级结构上相距较远,(3)活性中心为裂缝，或为凹陷，深入到酶分子内部，常为氨基酸残基的疏水基团组成的。 (4)活性中心具有柔性。,酶促反应：E + S = ES E + P 反应速度快慢,则主要取决于反应的活化能Ea。 催化剂的作用是降低反应活化能Ea,从而起到提高反应速度的作用,二、酶与底物分子的结合 1.活化能降低,从初态转化为过渡态需要能量，即为活化能（Energy of activation EACT），活化能越大，中间产物越难形成，反应越难进行。,反应过程中能的变化,在酶催化的反应中，第一步是酶与底物形成酶底物中间复合物。当底物分子在酶作用下发生化学变化后，中间复合物再分解成产物和酶。 E + S = E-S P + E 许多实验事实证明了ES复合物的存在。ES复合物形成的速率与酶和底物的性质有关。,2. 中间产物学说,3.锁钥学说,认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶表面具有特定的形状。酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样,刚性模式：Emil Fisher提出,4.诱导契合学说,该学说认为酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，而只是由于底物的诱导才形成了互补形状.,柔性学说：Koshland提出,1. 邻近效应和定向效应,邻近效应：酶与底物结合时，底物的敏感键逐渐靠近活性部位的催化基团。提高了反应基团的有效浓度。 定向效应：由于酶的构象作用，底物的反应基团之间、酶与底物的反应基团之间正确取向的效应,三、影响酶催化效率的因素,* 诱导契合假说(induced-fit hypothesis),酶底物复合物,酶与底物相互接近时，其结构相互诱导、相互变形和相互适应，进而相互结合。这一过程称为酶-底物结合的诱导契合假说 。,三、影响酶催化效率的因素,2.底物的形变,目 录,广义酸碱催化是指通过质子酸提供部分质子,或是通过质子碱接受部分质子的作用，达到降低反应活化能的过程。 酶活性部位上的某些基团可以作为良好的质子供体或受体对底物进行酸碱催化。 His 残基的咪唑基是酶的酸碱催化作用中最活泼的一个催化功能团。,广义酸基团 广义碱基团 （质子供体） （质子受体）,3.酸碱催化,4. 共价催化,A-X+EA+X-E X-E+BB-X+E 催化剂通过与底物形成反应活性很高的共价过渡产物，使反应活化能降低，从而提高反应速度的过程，称为共价催化。 酶中参与共价催化的基团主要包括 His 的咪唑基，Cys 的硫基，Asp 的羧基，Ser 的羟基等。,5.活性中心的微环境,疏水环境 介电常数低，加强极性基团间的作用。,酶催化反应机制的实例 胰凝乳蛋白酶 Chymotrypsin(EC 3.4.4.5) 分子量25 kDa。由三个多肽链通过两个二硫键连接。分子大小： 514040 A.。 有多个反平行-折叠区域，-螺旋很少。除去三个带电荷的氨基酸残基外其它所有带电荷的氨基酸均位于分子表面上。 催化中心： Ser195， His57， Asp102,反应分两个阶段; 第一阶段： 快速酰化形成酰基酶共价中间物；(共价催化;酸碱催化）,Ser195对底物肽键的羰基碳发生亲核攻击，His57获取质子。,四面体中间过渡态形成(与C连接的四个原子成四面体),Ser195-His57-Asp102形成催化三联体（catalytic triad） （Asp102稳定过渡态中带正电荷的His57 ）,肽键断裂，带氨基的产物游离；酰基-酶共价中间物形成。,第二阶段开始：水分子上的氧原子攻击羰基碳,第二阶段：酰基酶共价中间物慢速脱酰化。,His57获得质子，四面体中间物再次形成。,带羧基的产物游离下来，酶恢复原状。,反应特征 活性中心：Ser195，His57，Asp102 反应分两步：快速酰化和慢速脱酰化。 快速酰化（共价催化，酸碱催化，通过四面体过渡态和Ser195-His57-Asp102催化三联体完成） 慢速脱酰化（共价催化，酸碱催化）,1.关于酶的叙述哪项是正确的？ -( ) A.所有的酶都含有辅酶或辅基 B.大部分酶都是蛋白质 C.都能增大化学反应的平衡常数加速化学反应 D.都具有立体异构专一性 2. 关于酶的活性中心的叙述，哪项不正确？ -( ) A.酶与底物接触只限于酶分子上与酶活性有关的较小区域 B.必需基团可位于活性中心之内，也可位于活性中心之外 C.酶蛋白中主要是一级结构相邻的几个氨基酸的残基构成酶 的活性中心 D.当底物分子与酶分子接触时，可引起酶活性中心的构象改变 3.结合酶类必需由( )和( ) 结合后才具有活性，前者的作用是( ),后者的作用是( ) 。,B,C,4.L-精氨酸酶只能催化 L-精氨酸的水解反应，而对 D-精氨酸不起作用，这是因为该酶具有( )专一性。 5.常见的酶活性中心的必需基团有（ ） A半胱氨酸和胱氨酸的巯基 B组氨酸的咪唑基 C谷氨酸，天冬氨酸的侧链羧基 D丝氨酸的羟基 6.酶分子中的催化基团决定了酶的专一性。 ( ) 7.酶的绝对专一性是指： A.作用与一类化合物，催化一种反应 B.作用于一种化学键，催化一种反应 C.作用于一种底物，催化一种反应 D.作用于一种立体构型，催化一种反应,第三节 酶促反应动力学 Kinetics of Enzyme-Catalyzed Reaction,一、酶促反应速率的测定,（一）测定酶促反应速度的初速度（initial velocity ） 酶促反应产物浓度与反应时间进程曲线： 1. 随着反应时间延长，产物增加，加大了逆反应的进行； 2. 有可能产生产物抑制（反馈抑制）； 3. 酶部分失活。 只有初速度才代表酶的催化活力。 (底物消耗5%）。,（二）在最适条件下进行测定 （pH，T，离子强度） （三）反应体系中底物浓度要大大 超过酶量,概念 研究各种因素对酶促反应速度的影响，并加以定量的阐述。 影响因素包括有 酶浓度、底物浓度、pH、温度、 抑制剂、激活剂等。, 研究一种因素的影响时，其余各因素均恒定。,1、底物浓度对反应速度的影响：,酶浓度、pH、温度恒定。 （一）底物浓度曲线：VS关系 呈矩形双曲线，分三段： 1、当S较低时，V 随S增加而急剧增加，成正比关系，为一级反应。 2、随着S进一步增高，V 不再成正比加速，V 增加的幅度逐渐下降。 3、继续加大 S, V 不再增加，表现出零级反应，酶 的活性中心被底物饱和。,二、底物浓度对反应速度的影响,在其他因素不变的情况下，底物浓度对反应速度的影响呈矩形双曲线关系。,当底物浓度较低时,反应速度与底物浓度成正比；反应为一级反应。,目 录,随着底物浓度的增高,反应速度不再成正比例加速；反应为混合级反应。,目 录,当底物浓度高达一定程度,反应速度不再增加，达最大速度；反应为零级反应,目 录,2.米氏方程式（重点）,中间产物,酶促反应模式中间产物学说,S：底物浓度 V：不同S时的反应速度 Vmax：最大反应速度 m：米氏常数,米式方程的导出： 1、 早年的米式方程基于快速平衡假说,因为研究的是初速度，P的量很小，由P+EES可以忽略不记。,游离的酶与底物形成ES的速度极快（快速平衡），而ES形成产物的速度极慢，（即 K1、K2 K3 ）,ES生成速度： k1（E0 - ES）S ES分解速度： k2ES+k3ES 以上两个速度相等： k1（E0 - ES）S = k2ES+k3ES,2.用稳态假说推导米式方程： 稳态：是指ES的生成速度与分解速度相等，即 ES恒定,Vmax=k3 ES=k3E0,（米氏常数）,当Km及Vmax已知时，根据米氏方程可确定酶反应速度与底物浓度的关系。,当底物浓度很高，将酶的活性中心全部饱和时，即E0ES，反应达最大速度,米氏方程式推导基于两个假设： E与S形成ES复合物的反应是快速平衡反应，而ES分解为E及P的反应为慢反应，反应速度取决于慢反应即 Vk3ES。 (1) S的总浓度远远大于E的总浓度，因此在反应的初始阶段，S的浓度可认为不变即SSt。,当 S 很低时 ( S Km )： 即酶促反应V 与 底物浓度 S 成线性关系，表现为一级反应。 当 S 很高时（S Km）： 说明反应速度已达最大值， 此时，酶活性部位全部被底物占据，反应速度v与底物浓度S无关，表现为零级反应。,当反应速度为最大反应速度一半时,Km值的推导,Km S, Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位是mol/L。,(1) 当=Vmax/2时，Km=S。因此，Km等于酶促反应速度达最大值一半时的底物浓度。,3.Km和Vmax的意义,(2)Km是酶的特征性常数： 只与酶的性质有关，与酶的浓度无关。 在一定条件下，某种酶的Km值是恒定的，但是当pH、温度、离子强度等条件改变时，Km也会改变。,(3) Km可用来判断酶的最适底物： 当酶有几种不同的底物存在时，通过测定酶在不同底物存在时的Km值，Km值最小者，即为该酶的最适底物。,(5) 可根据Km计算某一底物浓度下反应速度相当于Vmax的百分率。 如当S=3Km时代入米氏方程,(4) Km可以反映酶与底物亲和力的大小。 Km越小，酶与底物的亲和力越大。,(6) Km可帮助推断某一代谢反应的方向和途径。 生物体的代谢作用往往是在多酶体系下进行的，同一种底物可以被几种不同的酶催化 如丙酮酸乳酸脱氢酶乳酸 Km=1.710-5 丙酮酸脱氢酶乙酰CoA Km=1.310-3 丙酮酸脱羧酶乙醛 Km=1.010-3 当丙酮酸浓度较低时，不能同时被几种酶作用，Km较小的酶促反应占优势，所以可以推断容易走乳酸脱氢酶催化丙酮酸形成乳酸的途径。,Vmax 定义：Vm是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度成正比。 Vmax也是一个常数，与Km相似， 同一种酶对不同底物的Vmax也不同，pH、温度和离子强度等因素也影响其大小。,意义：当S很大时，Vmax= k3 E k3为一个一级反应速率常数，表示当酶被底物饱和时每秒钟每分子酶转换的底物分子数，即转换数。 k3越大，表示酶的催化效率越高。,4.m值与max值的测定,1. 双倒数作图法(double reciprocal plot),双倒数作图法,斜率=Km/Vmax,-1/Km,1/Vmax,例题：1/v对1/S的双倒数作图得到的直线斜率为1.210-3min，在1/v轴上的截距为2.010-2ml.min/nmol，计算vmax和Km,作业：由过氧化氢酶催化地反应得到如下的数据 （1）计算vmax和Km （2）当S=2.510-4nmol/(L.min)时，酶促反应的速度是多少？,练习 1.向酶促反应体系中增加酶的浓度时，可出现下列哪一种效应 （ ） A不增加反应速度 B1/S对1/V作图所得直线的斜率减少 CVmax保持不变 DV达到1/2Vmax时的底物浓度增大,2.下列哪个不是推导米氏方程的假设条件（ ） A测定速度为反应初速度，即S消耗E CES解离生成E+S的速度显著快于ES形成P+E的速度，或称之为快速平衡学说 D当反应达到恒稳状态时，中间产物ES的形成速度不等于其解离速度,3下列酶促反应的叙述哪些是正确的（ ）不定项选择 A底物浓度过量和不受限制时，反应速度与酶浓度成正比 B底物浓度过量时，反应呈零级反应 C底物浓度低时，反应速度与底物浓度成正比 D底物浓度与酶浓度相等时可达最大反应速度,4.已知某种酶的 Km值为0.05mol/l，试问要使此酶所催化的反应速度达最大反应速度的80%时底物浓度应是多少？（ ） A0.04mol/l B0.8mol/l C0.2mol/l D0.05mol/l,5.本质是Pr的酶活性中心常出现的残基有Asp、Thr、Ser、 Glu等。（ ） 6. 辅酶与辅基的区别只在于它们与蛋白质结合牢固程度不同，并无严格的界限。（ ）,三、酶浓度对反应速度的影响,当SE，酶可被底物饱和的情况下，反应速度与酶浓度成正比。 关系式为：V = K3 E,1最适温度及影响因素 温度对酶促反应速度的影响有两个方面： 提高温度，加快反应速度。 提高温度，酶变性失活。 显示最大酶活力的温度， 叫作最适温度。大多数酶都有一个最适温度。 温度系数Q10：温度升高10，反应速度与原来的反应速度之比，大多数酶的Q10一般为1-2。 温血动物的酶，最适温度3540，植物酶最适温度4050，细菌Taq DNA聚合酶70。 最适温度不是酶的特征常数，它与底物种类、作用时间、pH、离子强度 等因素有关。,四、温度对酶促反应速度的影响,五、pH对反应速度的影响,最适pH (optimum pH)： 使酶促反应速度达到最大时的介质pH。,pH影响酶活力的因素,影响酶蛋白构象，过酸或过碱会使酶变性。 影响酶和底物分子解离状态，尤其是酶活性中心的解离状态，最终影响ES形成。 影响酶和底物分子中另外一些基团解离，这些基团的离子化状态影响酶的专一性及活性中心构象。,六、 激活剂对反应速度的影响,能够促使酶促反应速度加快的物质称为酶的激活剂。 酶的激活剂大多数是无机离子，如K+、Mg2+、Mn2+、Cl-等。,1、无机离子的激活作用 （1）金属离子：K+ 、Na+、Mg2+ 、Zn2+、Fe 2+ 、Ca2+ （2）阴离子：Cl-、Br -、PO43- （3）氢离子 不同的离子激活不同的酶。 不同离子之间有拮抗作用和可替代作用，如Na+与K+、Mg2+与Ca2+之间常常拮抗，但Mg2+与Zn2+常可替代。 激活剂的浓度不同，作用不同 对于NADP+合成酶， Mg2+ (510)10-3mol/L 激活作用 Mg2+ 3010-3mol/L 酶活性下降,2、 简单有机分子的激活作用 还原剂（如Cys、还原型谷胱甘肽）能激活某些活性中心含有SH的酶。 金属螯合剂（EDTA）能去除酶中重金属离子，解除抑制作用。,3、蛋白酶对酶原的激活,酶原 (zymogen) 有些酶在细胞内合成或初分泌时只是酶的无活性前体，此前体物质称为酶原。,酶原的激活 在一定条件下，酶原向有活性酶转化的过程。,酶原激活的机理,胰蛋白酶原的激活过程,胰蛋白酶对胰脏蛋白酶原的激活,酶原激活的生理意义,避免细胞产生的酶对细胞进行自身消化，并使酶在特定的部位和环境中发挥作用，保证体内代谢正常进行。 如出血性胰腺炎是由于蛋白酶在未进入小肠时就被激活，造成蛋白酶水解自身胰腺细胞。 有的酶原可以视为酶的储存形式。在需要时，酶原适时地转变成有活性的酶，发挥其催化作用。,七、抑制剂对反应速度的影响： 抑制剂（ inhibitor I ）：凡能使酶的催化活性下 降而不引起酶蛋白变性的物质。 抑制剂多与活性中心内、外必需基团相结合，从 而抑制酶的活性。 根据抑制剂与酶结合的紧密程度不同，酶的抑制 作用可分为： 不可逆性抑制 可逆性抑制：竞争性抑制、非竞争性抑制、 反竞争性抑制。,（一）不可逆性抑制作用 1、定义：抑制剂与酶的必需基团以共价键相结合 而引起酶失活，不能用透析、超滤等方 法予以去除。 二者结合，可以是局限于活性中心上的必需基 团专一性抑制剂 也可以不局限于活性中心上的必需基团非专 一性抑制剂,2、举例： 有机磷中毒： 作用于羟基酶，专一性抑制剂 有机磷化合物（农药敌百虫、敌敌畏、 1059等） 特异地与胆碱酯酶活性中心丝氨酸残基的羟基结 合，使酶失活。 解磷定 (PAM) 可解除有机磷化合物对羟基酶的 抑制作用。,有机磷胆碱酯酶磷酰化酶 乙酰胆碱 （活性 ） （失活） 磷酰化解磷定 解磷定 神经兴奋 胆碱酯酶 中毒症状 （活性）, 有机砷、有机汞化合物： 作用于巯基酶, 非专一性抑制剂 化学毒气路易士气（芥子气）是砷化物，可与酶 分子的巯基结合，抑制巯基酶的活性。 二巯基丙醇 (BAL) 又称抗路易士气，含有两个巯 基，可与毒剂结合，解除重金属盐引起的巯基酶 中毒。,路易士气巯基酶 失活的酶 人畜中毒 （活性） BAL与砷剂结合物 二巯基丙醇 巯基酶 （活性）,(3)烷化物 含卤素的烷化物（碘乙酸、碘乙酰胺、卤乙酰苯等）常用于鉴定酶中巯基。 (4)氰化物、硫化物、CO 与含铁卟啉的酶中的Fe2+结合，阻抑细胞呼吸 (5)青霉素 不可逆抑制糖肽转肽酶(与转肽酶活性部位Ser的OH结合，使酶失活),（二） 可逆性抑制作用,* 概念 抑制剂通常以非共价键与酶或酶-底物复合物可逆性结合，使酶的活性降低或丧失；抑制剂可用透析、超滤等方法除去。,竞争性抑制 非竞争性抑制 反竞争性抑制,* 类型,. 竞争性抑制作用,反应模式,定义 抑制剂与底物的结构相似，能与底物竞争酶的活性中心，从而阻碍酶底物复合物的形成，使酶的活性降低。这种抑制作用称为竞争性抑制作用。,特点： 1.I 与 S 结构类似, 与酶活性中心上的同一部位结合。 2.I 的存在阻碍 E 与 S 结合, E 和 S 亲和力, Km 。 3.抑制程度取决于 I 与 E 的相对亲和力大小 （ Ki ）及 I / S 比值：Ki 越大，抑制程度越轻；S I 时，抑制解除，Vmax 不 变。 4.动力学特点：Vmax 不变，Km 。,* 举例,丙二酸与琥珀酸竞争琥珀酸脱氢酶,蝶呤 对氨基苯甲酸 Glu,二氢叶酸合成酶,二氢叶酸,四氢叶酸,嘌呤核苷酸,二氢叶酸还原酶,一碳单位,磺胺类药物,磺胺类药物的抗菌机理：,TMP,2、非竞争性抑制作用 有些抑制剂可与酶活性中心外的必需基团结合， 不影响酶与底物的结合，酶和底物的结合也不影 响酶与抑制剂的结合。底物与抑制剂之间无竞争 关系，但酶底物抑制剂复合物 ( ESI ) 不能进 一步释放出产物。,2. 非竞争性抑制,* 反应模式,非竞争性抑制剂的特点： 1.I 与 S 结构上无类似性，可逆性结合在酶的不同部位 (活性中心外)，I 既能与 E 结合，也能与 ES 复合物结合成 ESI 化合物。 2.I 的存在并不影响 E 与 S的结合，Km 不变。 3.抑制程度取决于 I，与 S 无关，S不能解除抑制，Vmax。 4.动力学特点 ：Km 不变，Vmax。,3、反竞争性抑制作用 有些抑制剂仅与酶和底物形成的中间产物 ES 结 合，使中间产物 ES 的量下降，既减少从中间产 物转化为产物的量，也同时减少从中间产物解离 出游离酶和底物的量。,. 反竞争性抑制,* 反应模式,反竞争抑制的 特点： 1.I 只与 ES 复合物结合。 2.I 的存在促进了 E 与 S 的结合，E 与S 亲和，Km。 3.增加 S ，抑制程度, Vmax。 4.动力学特点：Km，Vmax。,各种可逆性抑制作用的比较,1对酶的抑制剂的叙述哪些是正确的（ ） A抑制程度与底物浓度无关时呈非竞争性抑制 B与酶可逆结合的抑制均呈竞争性抑制 C抑制程度取决于底物和抑制剂相对比例时呈竞争性抑制 D与酶不可逆结合的抑制均呈非竞争性抑制,2下面关于最适温度的论述，正确的是（ ） A温度远低于最适温度时，酶实际上处于失活状态，但未变性 B最适温度是酶的特征常数 C不同底物的最适温度不同 D在最适温度以上，随温度增高，反应速度加快,3.将具有绝对专一性的酶与底物的关系，比喻为锁和钥匙的关系还比较恰当.（ ） 4.米氏常数是酶的特征常数，与酶的底物无关。（ ）,AC,A,5 二巯基丙醇能够解除有机汞、有机砷化合物的毒性，说明此类重金属抑制剂作用于（ ） A-SH B-OH C-NH2 D-COOH 6.有机磷农药所结合的胆碱酯酶上的基团是（ ） A-COOH B-SH C-OH D-NH2,7关于酶的抑制作用的叙述，正确的是（ ） A可逆抑制作用是指加入大量底物后可解除抑制剂对酶活性的抑制 B不可逆抑制作用是指用化学手段无法消除的抑制作用 C非专一性不可逆抑制剂对酶活性的抑制作用可用于了解酶的必需基团的种类 D非竞争性抑制属于不可逆抑制作用,8.改变酶促反应体系中的pH，往往影响到酶活性部位的解离状态，故对Vmax有影响，但不影响Km。（ ）,A,C,C,9.在下列pH对酶反应速度的影响作用的叙述中，正确的是（ ） A所有酶的反应速度对pH的曲线都表现为钟罩形 B最适pH 值是酶的特征常数 CPH不仅影响酶蛋白的构象，还会影响底物的解离，从而影响ES复合物的形成与解离 D针对pH对酶反应速度的影响，测酶活只要严格调整pH为最适pH，而不需缓冲体系,10.关于酶的激活剂的叙述错误的是（ ） A激活剂可能是无机离子，中等大小有机分子和具蛋白质性质的大分子物质 B激活剂对酶不具选择性 CMg2+是多种激酶及合成酶的激活剂 D作为辅助因子的金属离子不是酶的激活剂,C,B,变构效应剂,变构调节 (allosteric regulation),变构酶,变构部位),一些代谢物可与某些酶分子活性中心外的某部分可逆地结合，使酶构象改变，从而改变酶的催化活性，此种调节方式称变构调节。,八、酶的别构调节,1.酶的别构（变构）效应： 别构酶(Allosteric enzyme)的特点： (1)一般是寡聚酶，由多亚基组成，包括催化部位和调节（别构）部位 (2)具有别构效应。指酶和一个配体（底物，调节物）结合后可以影响酶和另一个配体（底物）的结合能力。,相同（均为底物）：同促效应,不同（效应调节物）：异促效应,根据配体结合后对 后继配体的影响,根据配体性质,正协同效应,负协同效应,动力学特点：不符合米曼方程双曲线。,观察变构酶的底物浓度对酶促反应速度影响时，可发现S为一“S”形曲线。这是由于底物对变构酶存在同促正协同效应。,别构酶举例：天冬氨酸转氨甲酰酶，简称ATCase,第 4 节 酶活力的测定,酶活性: 指酶催化一定化学反应的能力 酶是否存在、含量多少-不直接用重量或体积表示， 用酶活力表示 1酶活力与酶反应速度 酶活力用反应速度表示酶催化的反应速度愈快， 酶活力愈高；速度愈慢酶的活力愈低,一、 酶活力的测定,所以研究酶的反应速度以酶促反应的初速度为准。,一般以测定产物为好-底物浓度为量，测定不准确；产物从无到有，准确。,2酶的活力单位,是表示酶量多少的单位， 1个酶活力国际单位（IU）: 特定条件下,在1分钟内能转化1微摩（mol）底物的酶量. 条件：温度25摄氏度,其它条件(pH及底物浓度)均采用最适条件。 “催量”，即Katal 每秒钟能使1mol/L底物转化为产物所需酶量。 1Kat=60106IU,3酶的比活力 酶含量大小，即每毫克蛋白所具有的酶活力单位. 单位：活力U/毫克蛋白or 活力U/克 or 活力U/ml） 对同一种酶来说，比活力愈高，表示酶纯度越高。 4酶的转换数kcat 每秒钟每个酶分子转换底物的微摩尔数（mol） 5.回收率=某纯化操作后的总活力/某纯化操作前的总活力 纯化倍数=每次比活力/第一次比活力,练习 1.从肝细胞中提取的一种蛋白水解酶的粗提液300ml，含有150mg蛋白质，总活力为360单位。经过一系列纯化步骤后得到的4ml酶制品(含有0.08mg蛋白),总活力为288单位，整个纯化过程的收率是多少？纯化了多少倍？,2.某酶制剂的比活力为42单位1mg蛋白，每ml含12mg蛋白质，计算当底物浓度达到饱和时，1ml反应液中含： （1）20l酶制剂时的反应初速度 （2）5l酶制剂时的反应初速度（单位为国际活力单位）； （3）该酶制剂在使用前是否需要稀释？,每ml酶制剂含有4212=504活力单位,（1）20ul酶制剂含有2010-3504=10.08活力单位 酶促反应速率为10.08umol/ml.min （2）5ul酶制剂含有510-3504=2.52活力单位,第 五 节 维生素与辅酶,概 述,定义 维生素(vitamin)是机体维持正常功能所必需，但在体内不能合成或合成量很少，必须由食物供给的一组低分子量有机物质。,分类:,共同特点 均为非极性疏水的异戊二烯衍生物 不溶于水，溶于脂类及脂肪溶剂 在食物中与脂类共存，并随脂类一同吸收 吸收的脂溶性维生素在血液与脂蛋白及某些特殊结合蛋白特异结合而运输 种类 VitA, VitD, VitE, VitK,脂溶性维生素,一、维生素A（抗干眼病维生素）,天然形式：A1（视黄醇） A2（3-脱氢视黄醇） 活性形式 ：视黄醇、视黄醛、视黄酸 动物肝脏中，尤其是鱼肝中含量最多 维生素A原：-胡萝卜素,（一）化学本质与性质,（二）生化作用及缺乏症 1. 生化作用 构成视觉细胞内感光物质（见后图） 参与糖蛋白的合成，维持上皮组织的分化与健全 其他作用，如影响细胞的分化 2. 缺乏症 夜盲症，干眼病，皮肤干燥等,视紫红质,视蛋白,11-顺视黄醛,全反视黄醛,暗处,光,视紫红质的合成、分解与视黄醛的关系,二 、维生素D（抗佝偻病维生素）,种类：VitD2（麦角钙化醇） VitD3（胆钙化醇） VitD2原：麦角固醇 VitD3原： 7-脱氢胆固醇 麦角固醇VitD2 胆固醇7-脱氢胆固醇VitD3 VitD3的活性形式： 1, 25- (OH)2-VitD3 植物中不存在VD,但有VD原,（一）化学本质和性质,肝25-羟化酶,维生素D3 （胆钙化醇）,肾,骨,胎盘中的 1-羟化酶,1, 25-二羟维生素D3 （1, 25-二羟胆钙化醇）,在体内的转变,24, 25-二羟维生素D3 （24, 25-二羟胆钙化醇）,肾,骨,胎盘、软骨 中的24-羟化酶,1. 生化作用 调节钙磷代谢，维持血钙和血磷水平，从而维持牙齿和骨骼的正常生长和发育。,2. 缺乏症 儿童佝偻病 成人软骨病 动物肝脏、鱼肝油、蛋黄中含量丰富,（二）生化作用及缺乏症,三、维生素E (抗不育维生素),（一）化学本质与性质 种类：生育酚，生育三烯酚 易自身氧化，故能保护其他物质。 （二）生化作用及缺乏症 生化作用： 1. 抗氧化作用 2. 维持生殖机能 在麦胚油、玉米油、花生油含量较高,四、维生素K（凝血维生素）,（二）生化作用及缺乏症 1.生化作用：促进凝血酶原的合成 2. 缺乏表现: 易出血，贫血和凝血时间长 蛋黄、苜蓿、绿色蔬菜和动物肝脏含丰富维生素K，另外人体肠道可以合成，故一般不会缺乏。,（一）化学本质及性质,天然形式：K1、K2 人工合成：K3、K4,共同特点 易溶于水，故易随尿液排出。 体内不易储存，必须经常从食物中摄取。,种类 B族维生素（ VB1、VB2、 VB6、 VB12 ） 维生素C、Vpp、泛酸、叶酸、肌醇,水溶性维生素,一、维生素B1（抗神经炎维生素）,维生素B1又名硫胺素, 体内活性形式为焦磷酸硫胺素(TPP),（一）化学本质及性质,焦磷酸硫胺素(TPP),TPP是-酮酸氧化脱羧酶的辅酶，也是转酮醇酶的辅酶。 在神经传导中起一定的作用，抑制胆碱酯酶的活性。,（二）生化作用及缺乏症,1. 生化作用,2. 缺乏症 脚气病，末梢神经炎,二、维生素B2（核黄素）,（二）生化作用及缺乏症 生化作用：FMN及FAD是体内氧化还原酶的辅基，主要起氢传递体的作用。 缺乏症：口角炎，唇炎，舌炎等。 肝脏、蛋黄、酵母、豆类和蔬菜中都含有,（一）化学本质及性质 维生素B2又名核黄素 体内活性形式为黄素单核苷酸(FMN) 黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD),Vit B2,FMN,AMP,FAD,VB2广泛存在于乳类、蛋类、肉类、谷类等。VB2是啤酒中唯一一种含量多的维生素 。 加工、烹饪和储藏食物过程中VB2有不同程度的损失。精米中大部分丢失。VB2对光十分敏感，牛奶中的损失大多是由于光照造成的，因此宜用深色玻璃瓶来盛装牛奶。由于VB2在碱性溶液中加热极易破坏，因而在加工时应避免使用小苏打等碱性物质。,三、泛酸和CoA,（一）化学本质及性质 泛酸(pantothenic acid)又名遍多酸 体内活性形式为辅酶A(CoA) 酰基载体蛋白(ACP) （二）生化作用及缺乏症 CoA及ACP是酰基转移酶的辅酶，参与酰基的转移作用。 酵母、肝、肾、花生等中含量较多 ，人体肠道可合成，一般不会缺乏,四、维生素PP,维生素PP包括 尼克酸(nicotinic acid)，烟酸 尼克酰胺(nicotinamide)，烟酰胺,体内活性形式 尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+) 尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+),（一）化学本质及性质,Vpp：尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+） 尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+）,OH若为OPO32-,则为NADP+,1. 生化作用 NAD+及NADP+是体内多种脱氢酶（如苹果酸脱氢酶、乳酸脱氢酶）的辅酶，起传递氢的作用。 * 烟酸可维持神经系统的正常功能,（二）生化作用及缺乏症,2. 缺乏症 癞皮病(皮肤上黑红色斑点、口炎、肠胃功能失常) 人体可利用色氨酸合成烟酸，大多数蛋白质都含有色氨酸。 玉米不含色氨酸,五、维生素B6,（一）化学本质及性质 维生素B6包括吡哆醇，吡哆醛及吡哆胺 体内活性形式为磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺,（二）生化作用及缺乏症 磷酸吡哆醛是氨基酸转氨酶及脱羧酶的辅酶 酵母、蛋黄、肝脏、肉类，人体也可合成,目 录,六、生物素（维生素B7或维生素H）,生化作用 生物素(biotin)是多种羧化酶（如丙酮酸羧化酶）的辅酶，参与CO2的羧化过程。,与羧基结合生 成羧基生物素,与赖氨酸残基-氨基结合成生物胞素,目 录,七、叶酸,生化作用：FH4是一碳单位转移酶的辅酶，参与一碳单位的转移。 缺乏症：巨幼红细胞贫血,（一）化学本质及性质,（二）生化作用及缺乏症,叶酸(folic acid)又称蝶酰谷氨酸 体内活性形式为四氢叶酸(FH4),叶酸,二氢叶酸还原酶,NADPH+H+,NADP+,二氢叶酸,二氢叶酸还原酶,NADPH+H+,NADP+,四氢叶酸,5, 6, 7, 8-四氢叶酸,目 录,八、维生素C,生化作用：参与氧化还原反应，参与体内羟化应，促进胶原蛋白的合成，促进铁的吸收。 缺乏症：坏血病,（二）生化作用及缺乏症,维生素C,脱氢维生素C,目 录,八、维生素B12,生化作用：参与体内甲基转移作用，变位酶反应 缺乏症：巨幼红细胞贫血、神经疾患 肝脏、牛奶、肉类中含量丰富,（一）化学本质及性质,维生素B12又称钴胺素 体内活性形式为甲基钴胺素 5 -脱氧腺苷钴胺素,（二）生化作用及缺乏症,R：5-脱氧腺苷 5-脱氧腺苷钴胺素,目 录,十、硫辛酸,生化作用 硫辛酸(lipoic acid)是硫辛酸乙酰转移酶的辅酶，起转酰基作用。,氧化型,还原型,3酶原所以没有活性是因为： A酶蛋白肽链合成不完全 B活性中心未形成或未暴露 C酶原是普通的蛋白质 D缺乏辅酶或辅基 E是已经变性的蛋白质 4.有机磷杀虫剂作为乙酰胆碱脂酶的抑制剂是作用于酶活性中心的： A. 巯基 B. 羟基 C. 羧基 D. 咪唑基,1.最适 pH 是酶的特征常数。 ( ) 2.丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制效应是 ( ) A.Vmax降低,Km不变 B.Vmax不变,Km降低 C.Vmax不变,Km增加 D.Vmax降低,Km 增加,5.关于pH对酶活性的影响， 项不对。 A. 影响必需基团解离状态 B. 也能影响底物的解离状态 C. 酶蛋白在一定的pH范围内发挥最高活性 D. 破坏蛋白质的一级结构,8.常见的酶活性中心的必需基团有： A半胱氨酸和胱氨酸的巯基 B组氨酸的咪唑基 C谷氨酸，天冬氨酸的侧链羧基 D丝氨酸的羟基 9.维生素B2在体内可转化为哪种成分？ A.NAD+ B.CoASH C.TPP D.FAD 10.缺乏维生素D与下列哪种病症有关？ A.口角炎 B. 脚气病 C.坏血病 D.佝偻病 11.含有金属元素的维生素是： A.B2 B.B6 C.PP D.B12,6. 关于温度对酶活性的影响，下列哪项叙述不对？ A.最适温度使酶的特征常数 B.温度降低酶促反应减慢 C.高温能使大多数酶变性 D.在一定范围内温度可加速酶促反应 7.关于酶的非竞争性抑制作用的说法哪些是正确的？ A增加底物浓度能减少抑制剂的影响 BVm降低 C抑制剂结构与底物无相似之处 DKm值不变,14.下列哪种维生素具有抗氧化作用？ A.硫胺素 B.核黄素 C.钴胺素 D.生育酚 15.与血液凝固有关的维生素是： A. 维生素A B.维生素D C.维生素K D