血吸虫病免疫诊断技术规范课件

血吸虫病免疫诊断技术 -现场应用技术规范 1 一、目前常用的血吸虫病免疫诊断类型与方法 1) 凝集反应 直接凝集试验 间接凝集试验 正向间接凝集试验-间接红细胞凝集试验（IHA） 反向间接凝集试验 间接凝集抑制试验 2) 沉淀反应 环卵沉淀试验（COPT） 3) 免疫电泳技术 经典的免疫电泳技术 对流免疫电泳 酶标记抗原对流免疫电泳 双向酶标对流免疫电泳 免疫印迹技术 4) 免疫标记技术 酶免疫测定-酶联免疫吸咐试验（ELISA） 免疫荧光法 放射免疫测定法 免疫胶体金技术-斑点金免疫渗滤试验（DIGFA渗滤法） 免疫胶体染料试验-胶体染料试纸条试验（DDIA层析法） 化学发光免疫分析 2 二、未稍采血（塑料管法）操作规程 1采血部位 通常取手指或耳垂。耳垂末梢血循环较差，受气温影响较大，冬季最 好不用；由于耳垂采血痛感较轻，病人容易接受，可先充分按摩，改善耳 垂末梢循环。手指采血应选择无名指。 2采血器材 一次性三棱针或弹簧刺血针、75%的酒精、无菌脱脂棉球、聚乙烯塑 料管（直径2mm，长8cm）、镊子、酒精灯等。 3 3采血方法 1）以手指按摩采血部位，使局部充血，再用75%酒精棉球消毒皮肤。 2）待干后用左手固定采血部位，右手持消毒针迅速刺入皮肤2-3mm，取 出刺针，血液即自行溢出。如血流不畅，可于四周稍加压力。 3）用消毒干棉球擦去第一滴血液，以后流出的血即可采用。 4）用塑料管进血口靠近血滴让血液自行流入管内，采集3cm血液(一次检测)。 5）采血完毕，刺处用消毒棉球拭擦干净。 6）采血后的塑料管将进血端留一小段空隙，靠近酒精灯烧熔管口，用镊子轻 轻夹住已基本溶化的采血管进血端约10秒,将进血端牢牢封住,贴上标签。 7）塑料管封口端朝下垂直于容器中，待血清自然析出或离心后，剪去塑料管之 血球部分，将血清移至中部，用于检测。或两端封口后放冰箱保存备用。 4 4注意事项 采血部位要严格消毒，做到一人一针；采血针忌用注射针头；采血针刺入速度 要迅速；有炎症部位不能采血；采血时切忌用力挤压；采血后伤口继续出血应 用干棉球压迫； 用塑料管收集血液时应尽量避免空气进入管内;如果空气进入管内可将塑料管 的另一端位置提高,以排除空气,然后继续采集血液到指定位置 可用普通离心机低速(1000-1500转)离心5分钟,以分离血清，防止离心过速或 过长。 塑料管封口要严密，防止血液流失。 用剪刀剪塑料管时应保持剪刀的清洁，避免交叉污染。 分离后的血清（或血浆）样品可置冰箱保存。 实验废弃物应按照相关规定处理，严禁随意丢弃。 5 三、间接红细胞凝集试验( IHA)操作规程 1 基本原理 抗原吸附于经适当处理的红细胞表面，使红细胞致敏。致敏红细胞与病人 血清中特导性抗体（抗SEA特异性抗体）相遇时，在适宜的条件下（电解质 、温度、pH），抗原与特导性的抗体相结合，使红细胞出现肉眼可见的凝 集反应。为正向间接凝集。 6 2 冻干致敏红细胞的制备工艺 u 血吸虫虫卵抗原制备 u 红细胞醛化 u 红细胞鞣化 u 红细胞致敏 u 致敏红细胞的冰冻干燥 致敏的新鲜红细胞保存时间短，且易变脆、溶血和污染，只能使用23 天。新鲜红细胞能吸附多糖类抗原，但吸附蛋白质抗原或抗体的能力较差。 为此一般在致敏前先将红细胞醛化，先用甲醛或戊二醛，再用鞣酸处理。醛 化红细胞能耐60加热，可长期保存而不溶血。并可反复冻融不破碎，在4 可保存36个月，在20可保存一年以上。 7 3 实验操作准备 1) 穿戴好工作服、口罩和手套等，做好基本实验准备工作。 2） 实验试剂和器材检查和摆放。要求试剂批号与有效期符合产品说 明；器材符合相关质量要求。 3) 检查完毕后，按照实验常规要求摆布好实验试剂和器材。 4） 实验试剂和器材准备 l实验试剂盒： 1. 冻干致敏红细胞（红瓶） 2. 致敏红细胞稀释液（蒸馏水、红瓶） 3. 标本稀释液（生理盐水、兰瓶） 4. 阳性对照品（冻干品、红色） 5. 阴性对照品（冻干品、兰色） 6. 使用说明书 8 l 器材： 1. 移液器100l一支、1000l（1ml ）一支、配套吸头、吸头盒及移 液器架等 2. “V”型反应板一块、白纸一张、记号笔 3. 旋转震荡器一台 4. 温箱一台 5. 实验记录纸、记录笔、废弃物杯 5) 实验准备要求： 待检血清（或血浆）要新鲜，不能有溶血或混有红细胞。 应选择“V”型，底角为90度的反应板。不要选择“U”型及不同底角的 “V”型反应板。 “V”型反应板要清洁、不潮湿，反应孔完好光洁。 试剂盒在有效期内 9 4 实验操作步骤 1) 样本编号，从左到右按1n号排列。 2） 取一块96孔“V”型反应板横向平放纵向使用。 血凝反应板编号：1）横 向（行）从左到右编号：1、2、3、阴、阳； 2） 纵向（列）从上 到下编号：1:5、1:10、1:20、1:40。 3） 稀释对照品：阴性对照、阳性对照品各加100l蒸馏水稀释溶解，加盖混 匀后放回原处备用。 4） 配置致敏红细胞悬液：启开安瓶，以每支冻干致敏红细胞加1ml致敏红细 胞稀释液（蒸馏水、红瓶）稀释混匀备用。 5) 启开标本稀释液（生理盐水、兰瓶）安瓶。 6） 调节移液器为100l。血凝反应板的第1行（横向）第1孔各加标本稀释液 100l。 10 7） 调节移液器为25l。血凝反应板的纵向（列）第24孔各加标本稀释液 25l。加液完毕，检查每孔是否有漏加孔或加双倍孔，并及时纠正。 8 ） 于第一排第1孔加1号待测血清25l，加完血清（盖上盖子）放回原处， 充分混匀（吸打4次，混匀吸打在第一档进行，移液吸头不能触碰反应孔 底壁） ,使血清成15稀释。（加血清时要核对一下样本编号防止加错 位）。 9） 在第1孔吸出25l于第2孔（纵向），同上混匀使血清成1:10稀释。后吸出 25l于第3孔（纵向），同上混匀使血清成1:20稀释。后吸出25l于第4 孔纵向），同上混匀使血清成1:40稀释,后吸出25l弃去，自动卸去吸头。 同上操作进行第2n号样本、阴性对照、阳性对照倍比稀释。倍比稀释 一个样本一个吸头。 11 10） 全部样品（及对照）倍比稀释完成后，调节移液器为75l，然后在第一行（纵 列第一孔）吸取75ml弃去，一个样本一个吸头。 11) 检查每孔液面是否在同一高度，否则应及时纠正。 12） 充分混匀致敏红细胞悬液（每加若干次要混匀一次），然后在每孔加致敏红细胞 悬液25l（原则上以每个样品为单位即列为单位加液），不需换吸头，但不能 触碰反应板，自动卸去吸头。 13） 先试一试震荡器，正常运转后将反应板震摇12分钟，盖上盖子，置37 (水 浴)30min后下垫白纸观察结果。并做好记录。 14） 记录结果后，实验台面清理：未使用试剂、未使用吸头、移液器（刻度复原至最 高档）等放回原处；实验废物放入规定的收集器内。 12 5 结果判定 1） 首先应观察对照管：阴性对照应不出现凝集现象，阳性对照应出现 凝集现象，结果方可成立。如出现异常则说明实验操作有误或血球 本身有自凝现象，试验结果不能成立。 2） 根据红细胞凝集程度以“”，“”，“”，“” 记录结果，以呈“”凝集的血清最高稀释度作为血清的效价, 以效价1:10作为阳性判断标准。 3） 报告形式：1:40阳性（） 13 4）血凝反应强度的判定如下： l：红细胞全部下沉在孔底，形成肉眼可见紧密、边缘光滑的小圆点。 l：多数红细胞下沉在孔底形成圆点，周围可见少量凝集红细胞，肉眼见周边模糊(或 中间出现较为明显的空白点) 。 l：孔底中心可见少量红细胞下沉的小圆点，多数凝集红细胞在孔底周围形成小薄 层 l：红细胞形成薄层凝集,边缘呈现不规则的皱褶。 14 6 注意事项 1） 结果观察时不能移动反应板，如条件限制则要非常小心慢移，切勿摇动反应板，以免凝集分 散，影响结果判断。结果观察时下垫白纸。 2） 血凝板以96孔“V”型底角应为90度有机玻璃板为适宜，确保所用器材清洁,血凝板清洗不能 用毛刷、移液吸头不能触碰反应孔,以避免损坏反应孔,造成假阳性。 3） 待测血清或血浆不能混有红细胞或被细菌污染。标本不能及时检测可在内4度保存2 3 天。长时间保存应放冰箱冻存。 4） 结果判断的时间与温度有关，应根据作业指导书在相同温度相同时间条件下判断。 5） 使用加样器加样，每测1个样本要更换滴头，在倍比稀释待检血清中，混匀时应避免产生气泡 （混匀吸打都在第一档进行）而影响吸量准确性。 6） 试剂盒于28避光保存。自检定合格之日起有效期为2年。醛化红细胞能耐60加热，并可 反复冻融不破碎，在4可保存36个月，在20可保存一年以上。从冰箱取出使用时先要 放室湿平衡一定时间。 15 1 基本原理 血吸虫病患者血清中存在的抗血吸虫抗体（IgG）与胶体染料 标记的日本血吸虫可溶性虫卵抗原（SEA)相结合，形成染料标记的 抗原抗体复合物，这复合物通过层析技术与固定在硝酸纤维膜上 的抗人IgG（二抗）相结合，形成可见的染色带，即为阳性反应。 四、胶体染料试纸条法（DDIA）操作规程 16 17 18 2 实验操作准备 1) 穿戴好工作服、口罩和手套，做好基本实验准备工作。 2） 实验试剂和器材检查和摆放。要求试剂批号与有效期符合产品 说明；器材符合相关质量要求。 3) 检查完毕后，按照实验常规要求摆布好实验试剂和器材。 4） 实验试剂和器材 u 实验试剂盒： l 1. 染料标记液 l 2. 试纸条 l 3. PVC小杯 l 4. 使用说明书 u 器材： l 1. 移液器50l一支、吸头、吸头盒及移液器架等 l 2. PVC小杯架、废弃物杯 l 3. 实验记录纸、记录笔、记号笔 5） 要求：1 待检血清要新鲜，不能有溶血或混有红细胞 19 3 实验操作 1） 样本编号1n号，并从左到右按1n号排列。 2） 取PVC小杯架子，装上PVC小杯（下垫白纸） 3） 编号： 横向（行）（标在小杯架子上）从左到右编号：1、2、3、 。做好相应 实验记录。 4） 轻轻颠倒混匀染料标记液，确保沉淀完全被混悬。 5） 调节移液器为50l。根据样品数每小杯加50l染料标记液至PVC小杯中。加液完毕，检查每孔是 否有漏加孔或加双倍孔，并及时纠正。 6） 调节移液器为20l。分别加20l待检血清（加血清时要核对一下样本编号防止加错位），每个样 本缓缓混匀（吸打4次），混匀时应避免产生气泡。整板样本加完后，检查每孔是否有漏加孔或加 双倍孔，并及时纠正。 20 7） 将整板放手上轻轻震荡，加血清一分钟（含混匀时间）后加试纸条。 8） 取试纸条插入小杯中，待小杯内反应液吸干后观察结果（15分钟）。 9） 在光线充足但非强光下观察，正面面向试纸条观察（阳性检测带一般 在对照带下0.9cm处，插入杯底斜靠时一般在PVC小杯上沿略上处，防 止误判），观察结束放回原处，记录结果。 10）实验台面清理：未使用试剂、未使用吸头、移液器（刻度复原至最高 档）等放回原处；实验废物放入规定的收集器内。 21 4 要求 1）标记液混均要轻，倒置时没有沉淀物后再颠倒2次； 2）一个样品一支吸头；加血清时要集中注意力切不可漏加或跳管或重叠； 3）取试纸条时，用手捏住吸水垫（较长的一端），严禁触摸检测膜或倒捏。 4）试纸条一定要入杯底。 5）试纸条面向自己排列整齐、一次放好，在结果观察前严禁触碰试纸条和小杯 架，也不要做台面清洁工作，防止试纸条顷倒； 6） 观察结果时要注意光线、方向，不要刻意判断，防止将“固相二抗”的折 光误判阳性。 22 5 结果判断 l 阳性反应：1）检测带和对照带都出现紫蓝色带。 2）检测带出现深紫蓝色带（反应强），对照带显色减 弱甚至不显色。 l 阴性反应：对照带出现紫蓝色带而检测带无显色带。 l 无效：检测带和对照带都不出现显色带。 6 储存条件及有效期 l 试剂盒保存于4 - 8，防止冷冻。 有效期6个月。 23 五、酶联免疫吸咐试验（ELISA）操作规程 24 1 基本原理 1) 抗原（日本血吸虫可溶性虫卵抗原SEA）以物理性地吸附于固相载体（聚苯乙 烯或聚氯乙烯塑料板）表面（包被），并保持其免疫学活性； 2) 加待检标本（有相应的特异性抗体）（一抗），即与固相上抗原结合，形成 抗原抗体复合物。 3) 加酶标记的二抗形成Ag-Ab1-Ab2*HRP三联复合物（第二抗体通过共价键与酶 连接形成酶结合物-辣根过氧化物酶（HRP）标记结合物），而此种酶结 合物仍能保持其免疫学和酶学活性； 4) 洗涤后加底物和显色剂（H2O2的邻苯二胺（OPD）或四甲基联苯胺（TMB）， 酶结合物中的酶再催化底物和显色剂反应，产生显色反应。 5) 根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深 浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程 度显示试验结果。 25 2 实验操作准备 1) 穿戴好工作服、口罩和手套，做好基本实验准备工作。 2) 实验试剂和器材检查和摆放。要求试剂批号与有效期检查符合产品说明；器材符合相 关质量要求。 3) 检查完毕后，按照实验常规要求摆布好实验试剂和器材。 4） 实验试剂盒(康百得)： 1）预包被板 （SEA预包被聚苯乙烯或聚氯乙烯塑料板） 48T/96T 2）酶结合物（1号液） （辣根过氧化物酶（HRP）标记结合物） 1支 3）洗涤液（2号液） 1支 4）底物（3号液） （四甲基联苯胺（TMB） 1支 5）显色剂（4号液） （H2O2 ） 1支 6）样本稀释液（5号液） 1支 7）终止液（6号液） （硫酸（H2SO4） 1支 8）阳性对照品（冻干品） 1支 9）临界对照品（冻干品） 1支 10）阴性对照品（冻干品） 1支 11）使用说明书 1份 26 5）实验器材： 移液器20l、100l、1000l各一支、200l、1000l吸头及吸头盒和移液器架 样品稀释板 酶标板架 塑料洗瓶（装蒸馏水） 恒温水浴箱一台 吸水纸、废弃物杯 实验记录纸、记录笔、记号笔、剪刀 6）血清样本检查，要求：1 待检血清要新鲜，不能有溶血或混有红细胞 或脂血或严重黄胆或已污染， 27 3 操作程序 1 ） 样本编号：样本编号1n号，排列，并做好记录。 2） 样品稀释板编号：选取一块样品稀释板横向平放纵向使用。 横向（行）从左到右编号：1、2、3、 3） 样本稀释： 样品稀释板内每孔加入样本稀释液（5号液）500l，根据样本数一次全部加完。 分别加入待检测血清5l（待检测血清按1：100稀释），充分混匀（吸打4次）。 4）阴性、临界、以及阳性对照每支加入300l蒸馏水复溶，充分溶解后放置样品稀释 板边以阴性、临界、阳性对照品排列。 5）加样反应： 取预包被板放入板架内，安好，标记好或安排好样品与对照位置，并做好记录。 样本检测孔第1-n孔每孔分别加已稀释样本血清100l，取样时要将样品吸打几次混均 后再吸。 每板最后依次为阴性、临界、阳性及空白对照孔，分别加入复溶后的阴性、临界、阳 性对照液及样本稀释液（5号液）各100l。 6）置37水浴箱避光反应30分钟后甩去孔内液体。 28 7） 洗涤： 每孔加洗涤液（2号液）1滴(滴瓶垂直加液，下同)，立即用蒸馏水注满（ 首次加蒸馏水时尽量不要溢出孔外，以免抗体溢出到临孔），静置30秒后甩 去，再直接用蒸馏水洗涤四次，每次均需静置30秒。最后一次甩去拍干。 8）加酶反应: 除空白对照孔外其余每孔加酶结合物（1号液）2滴，置37水浴箱避光 反应30分钟后甩去孔内液体，如上洗涤，拍干（关健操作：要洗涤到位并拍 干，否则可能产生假阳性）。 9）显色反应： 加底物（3号液）1滴。 加显色剂（4号液）1滴，混匀（轻轻敲打）。 置37水浴箱避光显色10分钟。初步观察，做好预记录。 加终止液（6号液）1滴，混匀，终止反应（加终止液后蓝色会变为黄色 ，无色的仍然无色）。 置白纸上观察结果。 29 4 结果判断 1） 肉眼观察： 空白无色，阴性对照无色或接近无色，临界对照呈浅黄色，阳性对照呈明显黄色，表 示实验有效。 待检孔无色或呈浅于临界对照孔的微黄色表示该标本为阴性，待检孔呈深于临界对照 空的黄色表示该标本为阳性。 2）仪器判断： 以空白对照调零，用酶标仪于450nm（TMB）（620nm作参比波长）读取OD值，待 检孔OD值大于阴性对照P/N2.1倍者为阳性。当阴性对照OD值低于0.05时按0.05计算 。 3）结果记录 30 结果判断结果判断 目测判读结果 B1-7,10-11,D1-2为正常血清， B8、9,12及D3、4为血吸虫病人血清； D5阴参，D6临界，D7阳参，D9空白 病人血清 阴参临界 阳参 正常人血清 31 31 结果判断结果判断 加2M H2SO4后 32 32 ELISAELISA结果结果 B1-7,10-11,D1-2为正常血清， B8、9,12及D3、4为血吸虫病人血清； D5阴参，D6临界，D7阳参，D9空白 测定OD值 33 33 5 注意事项 1）试剂盒在2-8保存，冰冻失效、温度过高保存活性降低。每次取出 时先平衡至室温后使用。滴瓶每次用后一定要将盖拧紧，各瓶盖之间 切不可混用。各试剂盒之间不可混用。 2）洗涤时将蒸馏水加满孔内，每次停放30秒钟后，甩去孔内液体。禁用 自来水等其他水源。 3）为提高实验的可比性建议使用仪器判读结果，并对阴性对照测复孔以 减少误差。 4）洗涤要彻底，特别是酶结合物反应后，洗涤一定要充分； 5）OPD对光非常敏感，应避光反应；结果应尽快检测 6）酶标反应均应在湿盒中进行。 34 六、斑点免疫金渗滤法（DIGFA）操作规程 35 1 试验原理 将抗原（日本血吸虫可溶性虫卵抗原SEA）包被于硝酸纤维素薄膜 ( 微孔滤膜)上,滴加在膜上的待检血清通过滤膜时，其中的抗体与膜上的抗 原相接触，起到亲和层析的浓缩，形成抗原抗体复合物。然后，红色胶 体金颗粒标记的第二抗体所形成的金标探针，与复合物中的抗体结合， 滞留在反应板上，形成肉眼可见的红色斑点。 36 3 实验操作准备 1) 穿戴好工作服、口罩和手套，做好基本实验准备工作。 2) 实验试剂和器材检查和摆放。要求试剂批号与有效期检查符合产品说明；器材符合相关 质量要求。 3) 检查完毕后，按照实验常规要求摆布好实验试剂和器材。 4）实验试剂盒： 1）预处理空白反应板(含质控点) 2）洗涤液 3）金标抗体液 4）使用说明书 5）器材： 1. 移液器50l、200l吸头、吸头盒及移液器架 2. 实验记录纸、记录笔、记号笔。 6）被检样血清检查，要求：本方法对待检血清要求高，要仔细检查，详见注意事项。 37 4 操作程序 1） 将试剂盒、试剂取出，置予室温下平衡 2） 样本编号：样本编号1n号，从左到右按1n号排列，并作好记录。 3） 取n块预处理空白反应板(含质控点)放好并编号。 4） 按顺序每次取2块板，依次在反应孔中间位置加入2滴洗涤液，待液体完全渗透 5） 依次在每块板反应孔正中间垂直加入25l新鲜特检血清（对应编号），待血清 完全渗透。 l（关健操作：1、如没完全渗透就加液可呈假阴性，但过干后再加液则呈假阳 性。2、完全渗透的标准是膜上特别是孔周边折光液体消失） 38 6） 依次在每块板加入2滴洗涤液，待液体完全渗透。 7） 依次在每块板加入4滴金标抗体液，待液体完全渗透。 8） 依次在每块板加入2滴洗涤液，待液体完全渗透，观察结果。 9） 按顺序取下一轮2块板，同上进行第3和第4份、第5和第6份、样 本检测。 10） 样品全部检测完成后复查结果（但必须控制在1小时内），并记录。 11）清理台面，移液器调至最高档。 39 5 结果判断 判断结果的时间应以完成操作后，即时观察为准。部分品种在放 置数小时或1日后，结果会发生变化 l 1）出现两个红色圆点为阳性； l 2）出现一个红色圆点为阴性； l 3）无圆点（呈白板状）表示试剂失效或操作有误，应当重新测试 40 6 注意事项 l 1）本试验对血清标本要求高，最好应用新鲜血清。测定血清标本要求离心分 离以消除血脂的影响(4000转分，15分钟或8000转l分，5分钟)，不宜用 未稍采血（塑料管法）样本。吸取血清标本时，应避开血脂、纤维蛋白或沉 淀等，取其清亮透明部分。 l 2）试剂盒从冰箱取出后应恢复至室温才能使用，试剂盒最佳使用温度是30 37。 l 3）以2个样本为一批依次进行操作。血清样品加样时，应在反应孔的正上方 垂直加样。 l 4）待反应板上的液体完全渗透后，立即加入下一种液体。既要防止渗透不全 ，又须避免反应膜干枯（是本试验操作的关键）。在加液时应避免出现气泡 ，尤其是金标液。 l 5）判断结果以即时观察为准若较长期保存，将反应板正面朝下放置即可。 l 6）于2-8冷藏保存，切勿冷冻应当避免强烈光照和高温。检测完毕后,未用 的反应板要立即放入自封袋中密闭冷藏。41 七、移液器的使用规程 1 量程的调节 l 在调节量程时，逆时针或顺时针按照正常的调节方法，旋转旋钮即可 ;在该过程中，千万不要将按钮旋出量程，否则会卡住内部机械装置 而损坏了移液枪。 2 枪头(吸液嘴)的装配 l 方法是将移液枪(器)垂直插入枪头中，稍微用力左右微微转动即可使 其紧密结合。如果是多道(如8道或12道)移液枪，则可以将移液枪的