（中山二院）20111026输卵管妊娠的临床与基础研究课件

输卵管妊娠的临床与基础研究 广州中医药大学第一附属医院妇科 博士生导师、博士后合作教授 教授、主任医师 邓高丕 前 言 研 究 背 景 l 近20年来，异位妊娠的发病率明显上升，已成为 妇科的常见病和多发病。 l 诊断技术的发展、妇科医师水平的提高，多数异 位妊娠能在早期疑诊。 l 基于生育力、安全性等因素的考虑，在治疗时面 临最佳治疗方案的选择。 l 何时适合手术治疗，何时适合药物治疗，尚缺乏 合理的量化指征。临床上存在过急手术或盲目药 物治疗的倾向。 开展该系列研究已超过12年，包括： 临床实验研究：回顾性研究 前瞻性研究 验证性研究（全国7个中心） 总病例数超过4000例。 基础实验研究： 本人在该系列研究中获得的基金支助： 2项国家自然科学基金， 1项国家科技部科研专项基金， 1项广东省自然科学研究基金， 4项广东省科技计划项目。 （总经费180多万元） 已取得的研究成果： u 发表了该系列研究论文20多篇。 u “输卵管妊娠的临床研究”- 2007年通过广东省科技厅的成果鉴定，评价 为“国内领先水平”。 获2007年度中国中西医结合学会科学技术三 等奖。 u 该诊疗方案已编入多部中医妇科学、中 西医结合妇产科学规划教材及中华中医药学会 妇科常见病中医诊疗指南 u 该系列研究已培养博士、硕士生13人。 一、异位妊娠发病相关因素的研究 发病与患者的盆腔炎史、输卵管手术史、剖宫 产史、人流史、生育史和IUD呈密切相关。 在月经不调史、痛经史、阑尾炎手术史、自然 流产史和不孕史中，异位妊娠组与对照组无显 著性差异。 二、早期输卵管妊娠的诊断 早期的输卵管妊娠-确诊比较困难。 输卵管妊娠未破裂或未流产时，无明显的症状和 体征。 当有月经延迟，并伴少量阴道流血时： 应注意早期输卵管妊娠的可能。 特别对有不孕或异位妊娠史，或带IUD者，更应 警惕。 对疑诊的早期输卵管妊娠应选择下列检查 ： 1、血-HCG动态测定 2、阴道B超检查 3、腹腔镜检查 1、血-HCG动态测定 宫内妊娠及输卵管妊娠的-HCG水平， 在很早期不易区分。但-HCG的动态变化对 诊断及鉴别诊断有很大帮助。 （1）若-HCG上升： 根据上升的幅度，鉴别宫内妊娠与输卵管妊娠: 早期宫内妊娠，绒毛所分泌的HCG量很大，48 小时上升60%以上。 输卵管妊娠时，输卵管肌层血液供应不良，HCG 分泌少，48小时上升不及50%。 （2）若-HCG下降： 可发生在输卵管妊娠、将要流产的宫内妊娠。 HCG下降很快,半衰期5cm时， 选择中西药结合治疗。 胎元阻络型 未 破 损 期 上述评分和治疗都是动态的，应根据 患者评分的变化及时调整治疗方案。 注注 意！意！ 先用活血化瘀，杀胚止痛法： 宫外孕号方（丹参、赤芍、桃仁）加天花 粉20g、紫草15g、蜈蚣6g。每日1剂，再煎服。 血府逐瘀口服液10ml口服，一日三次。 双柏水蜜（侧柏叶、黄柏、大黄、薄 荷、泽兰 ） 外敷下腹患侧，一日一次。 疗疗 治治 药药 中中 经治疗稳定, HCG转阴者, 改用活血散结, 消癥化瘀法： 宫外孕号方（丹参、赤芍、桃仁、三棱、莪术） 加味。 散结镇痛胶囊 4片口服，每日三次。 双柏水蜜外敷（同前）。 复方毛冬青液（毛冬青、败酱草、银花藤、大黄、 枳壳等）100ml保留灌肠，一日一次。 西药用： 米非司酮150mg口服，每日一次，连服5天。 或甲氨喋呤（MTX）50mg/m2，单次肌注。 若停药一周-HCG下降不显著，加用MTX50mg，肌注一次。 （为什么要停药一周？ 后述！） 中药治疗同前。 中西药结合治疗中西药结合治疗 根据手术探察情况，分别施行： 患侧输卵管切除术， 或保守性手术。 手手 术术 治治 疗疗 药物治疗的疗效标准 痊愈：内出血停止，腹痛、局部体征消失；妇科检 查及B超检查输卵管妊娠包块基本消失；-HCG测 定连续两次阴性。 有效：内出血停止，腹痛消失，局部体征基本消 失；妇科检查及B超检查输卵管妊娠包块缩小1/2以 上；-HCG测定连续两次阴性。 无效：腹痛加剧或伴失血性休克、妇科检查及B超检 查输卵管妊娠包块增大；-HCG持续阳性且有增高 趋势，需改行手术治疗者。 讨 论 未破损早期胎元阻络型： 当积分8分时，药物治疗的疗效较好。若- HCG 1000IU/L，此时胎元的活性不强，可选择中药 治疗；若-HCG1000IU/L或包块直径5cm，则要加 用西药杀胚。 当积分=910分时，可先选择中西药结合治疗，但 应慎重。 当积分11分时，不宜药物治疗。 未破损晚期的胎瘀阻滞型：均可用中药治疗。 绝大部分胎瘀阻滞型的-HCG值均较低或阴性， 故不需用西药杀胚。 已破损期气血亏脱型： 对于气血亏脱型，不论积分多少均应及时手术治疗 。 已破损期正虚血瘀型： 积分9分，当-HCG1000IU/L时，中药治疗。 当-HCG1000IU/L时，中西药结合治疗。 积分10分，选择手术治疗。 已破损期的瘀结成癥型： 积分= 910分，选择中药治疗。 积分11分，选择手术治疗。 临床研究证明，应用上述的辨证体系及其辨证论治 方案治疗输卵管妊娠： 1、能较准确地判断患者的病情和预后转归， 2、把握了中医“证候”的本质， 3、有利于及时采取合理的中西医治疗措施，避免 临床上过急手术或盲目药物治疗的倾向。 4、能取得较高的临床疗效（药物治疗的总有效率 达到88.9%以上，手术治疗的治愈率为100%）。 八、 药物治疗输卵管妊娠的 血清-HCG变化研究 （2006.12009.12） 注意第10天前后的变化曲线。 胎元阻络（中药治疗组）血清-HCG下降 百分比变化曲线图 胎元阻络（中西治疗组）血清-HCG下降 百分比变化曲线图 正虚血瘀（中药治疗组）血清-HCG下降 百分比变化曲线图 正虚血瘀（中西治疗组）血清-HCG下降 百分比变化曲线图 该研究结果显示： 药物治疗出现明显疗效的时间点在第10天 左右。 提示：对医生？ 对患者？ 九、临床应用基础研究 （一）研究内容 采用前瞻性的对照研究方法：观察活血化瘀 、消癥杀胚中药宫外孕I号方加味对输卵管妊娠的 作用机制。 将中药治疗后再手术切除的输卵管和直接手术 切除的输卵管：采用免疫组化的方法，检测输卵管 妊娠部位的输卵管粘膜的ER、PR表达及绒毛的Bcl- 2表达，通过电子显微镜观察输卵管粘膜上皮细胞 的超微结构变化。 1、治疗组（15例）： 宫外孕I号方（丹参15g、赤芍15g、桃仁15g） 加天花粉20g、紫草15g、蜈蚣6g，每日一剂，两次 水煎服。采集中药治疗47天，因患者要求改为手 术治疗而切除的妊娠输卵管。 2、对照组（15例）： 直接要求手术治疗的患者的妊娠输卵管。 （二）研究方法 1、Bcl-2差异性比较 两独立样本的 U检验，P=0.0030.05，治疗组Bcl- 2的表达强度低于对照组，差异具有统计学意义。 两个独立样本的K-S检验， P=0.0090.05，治疗组 Bcl-2的表达强度低于对照组，差异具有统计学意义。 （三）研究结果 2、ER差异性比较 两独立样本的U检验，P=0.6830.05，两组ER表达强度 差异不具有显著性。 两个独立样本的K-S检验，P=0.9250.05，两组ER表达 强度差异不具有显著性。 两独立样本的 U检验，P=0.0130.05，治疗组PR的表 达强度低于对照组，差异具有统计学意义。 两独立样本的K-S检验，P=0.0280.05，治疗组PR的 表达强度低于对照组，差异具有统计学意义。 3、PR差异性比较 4、两组电镜评分比较 U检验两组电镜检测总分比较 P=0.0000.05，治疗组的 总分高于对照组，差异具有统计学意义。 K-S检验两组电镜检测总分比较 P=0.0010.05，治疗组 的总分高于对照组，差异具有统计学意义。 附：输卵管粘膜上皮细胞超微结构电镜观察评分表 胞内大空泡胞内小空泡胞内未见空泡 细胞内空泡 内质网扩张形态正常 内质网 核小固缩 结构消失 电子致密 出现异染色质 形态正常 细胞核 线粒体脊模糊 、 肿胀、空化 电子致密形态正常线粒体 稀疏介于稀疏浓密之 间 浓密 纤毛微绒毛 210评分 项目 （四）研究结论 1、活血化瘀消癥杀胚中药可降低输卵管妊娠绒毛 组织Bcl-2表达水平，从而阻碍了Bcl-2的抗细胞 凋亡作用，促进了输卵管妊娠胚胎组织凋亡。 2、活血化瘀消癥杀胚中药可降低妊娠输卵管粘膜 PR表达水平，从而降低孕酮与PR的结合，阻碍孕 酮对输卵管妊娠的支持作用，导致胚胎死亡。 3、活血化瘀消癥杀胚中药对妊娠输卵管粘膜ER表 达水平无影响。 4、活血化瘀消癥杀胚中药对妊娠输卵管粘膜细胞 超微结构（微绒毛、线粒体、细胞核、内质网） 均有明显影响，提示活血化瘀消癥杀胚中药能够 影响妊娠输卵管粘膜细胞的生理代谢过程的正常 进行，从而影响着床在输卵管的胚胎组织的营养 供给，促进胚胎组织死亡。 十、基础实验研究 （简介其中的2个基础研究） (一) 基于 HPLC-MS 质控下的 化瘀消癥杀胚中药对人输卵管妊娠 滋养细胞影响的研究 （研究已基本完成） 本研究提出的科学假说： 1、化瘀消癥杀胚的中药复方可能通过降低 ER、PR 的表达 影响外周绒毛滋养层细胞的旁分泌；改变MPPs 的表达来 影响其自分泌和蜕膜组织协调分泌的协调作用； 2、抑制滋养细胞穿过输卵管内膜上皮及血管基膜，进而阻 止滋养细胞在母体输卵管组织中的迁移和浸润； 3、影响抑制细胞凋亡基因，通过控制外周绒毛滋养层细胞 的侵袭力而降低滋养层细胞的活性。 4、上述的影响协同起到化瘀消癥杀胚的作用。 本研究通过： 1、以化瘀消癥杀胚中药(宫外孕复方)作为干预手段， 以体外培养的人输卵管妊娠滋养细胞作为研究对象。 2、通过高效液相-质谱联合分析方法（HPLC- MS）分 别对化瘀消癥杀胚中药(宫外孕复方)进行中药复方指 纹图谱分析、对灌服宫外孕复方的SD大鼠血清及空白 SD 大鼠血清进行检测并定性差比分析。 3、用经质控有化瘀消癥杀胚有效物质的大鼠含药血清，对 人输卵管妊娠滋养细胞进行体外培养。通过: 采用光镜、电镜观察化瘀消癥杀胚中药复方对输卵管绒 毛蜕膜组织结构的影响； 用流式细胞术（FCM）进行绒毛蜕膜细胞DNA 含量分析 ，观察宫外孕复方对输卵管妊娠滋养细胞凋亡及其相关基因 Bcl-2 的表达； 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测化瘀消癥杀胚的宫外孕 复方对雌激素受体(ER）、孕激素受体（PR）、基质金属蛋白 酶(MMP)表达的影响。 上述研究结果： 从细胞、亚细胞组织结构、分子、基因水平上 ，系统探讨了化瘀消癥杀胚中药复方对输卵管妊娠 滋养细胞靶器官的作用机制。并验证了在研究前提 出的科学假说。 （二） 基于微环境调控作用 探讨化瘀消癥杀胚中药对 早期异位妊娠滋养细胞的调控机制研究 （研究正在进行中） 我们在前期研究工作中发现： 1、消癥杀胚中药对妊娠输卵管粘膜细胞超微结构 （微绒毛、线粒体、细胞核、内质网）均有明显 影响，提示活血化瘀消癥杀胚中药能够影响妊娠 输卵管粘膜细胞的生理代谢过程的正常进行，从 而影响着床在输卵管的胚胎组织的营养供给，促 进胚胎组织凋死亡。 2、化瘀消癥杀胚的中药复方能改变MPPs等的表达 来影响其自分泌和蜕膜组织协调分泌的协调作用 ，抑制滋养细胞穿过输卵管内膜上皮及血管基膜 ，进而阻止滋养细胞在母体输卵管组织中的迁移 和浸润，通过控制外周绒毛滋养层细胞的侵袭力 而降低滋养层细胞的活性。 以上研究向我们提出了一些有趣的问题 ： 异位妊娠的病理复杂，但其发病机制的关 键是什么？是滋养细胞？还是其侵袭的微环 境？ 我们已经对人输卵管组织绒毛滋养细胞和体外 细胞进行了系统研究，能否将这一病理关键问题 客观、稳定地反映在体内动物模型中？弥补异位 妊娠缺少有效的体内动物模型的空白，并验证体 外模型实验结果，以达到在体与离体试验的相互 印证。 因此我们又提出了两个新的科学假说： 1、异位妊娠是由多种发病机制共同作用的结果，但“滋养 细胞-侵袭微环境”是其发病的关键窗口，两者可能是异位 妊娠发生的“种子”和“土壤”关系。 2、化瘀消癥杀胚中药复方可能通过对抑制滋养细胞侵袭 的微环境（土壤），进而干预滋养细胞（种子）向周围组 织的侵袭，从而起到治疗早期异位妊娠的作用。 。 本研究将通过以下3个方面的实验，以验证提出 的科学假说 ： 1、以化瘀消癥杀胚中药复方为研究工具，运用细胞学和 裸鼠移植技术，建立人