复方丹参的药效学研究

浅论冠心丹参注射液药效学研究 【摘要】 目的 观察冠心丹参注射液对健康成年 SD 大鼠心肌缺血再灌注损伤 的保护作用。方法 SD 大鼠以结扎冠脉 30 min 再灌注 90 min 造成心肌缺血再 灌注损伤模型，通过观察血流动力学、生物化学和组织学指标，评价大鼠缺血 再灌注前冠心丹参片预处对左心室收缩压(LVSP)、左心室发展压(LVDP)、左心 室舒张末压(LVEDP) 、左心室等容期压力最大变化速率(dpdtmax) 等指标的影 响；通过测定再灌注 90 min 后血中乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK) 活性和心 肌组织病理学观察，对药物保护心肌作用进行评价。结果 表明冠心丹参注射液 可有效改善缺血再灌注心脏的缩舒功能；降低缺血再灌注末期血中 LDH 和 CK 活性；组织病理学检查表明：与溶剂对照组比较，冠心丹参注射液预处理组能 明显减轻心肌组织的损伤。结论 冠心丹参注射液有抗大鼠缺血再灌注引起的心 肌损伤作用。 【关键词】 冠心丹参注射液；心肌保护；缺血再灌注 Abstract：Objective To observe the cardioprotective effects of Guanxin Danshe n injection on myocardium injury induced by ischemia reperfusion in anesthetiz ed adult SD ratsMethods The myocardial injury of rats induced by ischemia- reperfusion was produced by the ligation of left coronary artery for 30 min fol lowed by 90 min reperfusionThe influence of Guanxin Danshen injection on the changes of biochemistry，histology and hemodynamics，such as LVSP，L VDP ，LVEDP and dpdtmax，were evaluatedThe serum lactate dehydroge nase(LDH) and creatine kinase(CK)activities were assayed by the end of the re perfusionResults The systolic and diastolic functions were improved，and the serum LDH and CK activities were reduced in Guanxin Danshen injection 100 mg/kg iv groupThe histology changes were manifestedThe pretreatment of Guanxin Danshen injection alleviated the myocardial damage distinctly，compar ed with ischemia-reperfusion groupConclusions The experimental results demo nstrate the effects of Guanxin Danshen injection on myocardial injury induced by ischemia-reperfusion in anesthetized rats Key words:Danshen Guanxin injection; myocardial protection; ischemia reperfusi on 1 冠心丹参注射剂的优点及提取工艺简介 天然植物中有许多活性物质具有抗心肌缺血，缺氧作用，其中一些已开发成治 疗冠心病和心绞痛的新药。冠心丹参片的主要成分为丹参，三七，降香油，具 有活血化瘀，理气止痛的作用。用于气滞血瘀所致的胸闷，胸痹，心悸气短； 冠心病等上述证状者。片剂口服虽然相对安全但起效慢，尤其在治疗一些急症 时，凸显出剂型的不足，所以将具有抗心肌缺血，缺氧活性的有效物质制成注 射剂无疑是抢救和治疗冠心病和心绞痛等突发疾病的最佳方案。 丹参 1 000 g，10 倍量水回流提取 3 次，每次 2 h，合并提取液，浓缩至 0.2 g 生药/mL,用 D101 大孔吸附树脂处理，先用 2 BV 注射用水洗脱，然后用 3 BV 80%乙醇洗脱，收集洗脱液浓缩至 0.2 g 生药/mL；三七粗粉 1 000 g（过 40 目 筛），浸泡 40 min，用 10 倍量 70%乙醇回流提取 3 次，每次 2 h，合并提取 液浓缩成 0.2 g 生药/mL，然后吸取提取液用已经预处理好的 D101 大孔吸附树 脂柱处理：先用水洗至流出液不显 Molish 反应，然后用 3 BV70%乙醇洗脱， 流速为 1.5 mL/min，收集洗脱液浓缩成 0.2 g 生药 /mL；降香饮片 1 000 g，加 水 8 倍量，水蒸汽蒸馏提取 11 h 收集蒸馏液，冷藏 24 h，分去上层油层。 合并上述三液，加注射用水成 1 000 mL，加入注射剂用活性炭，用量为 0.5% ，加热回流 30 min，减压抽滤过孔径为 0.45 m 的微孔滤膜灌封于 2 mL 的安 瓿中采用流通蒸汽灭菌法灭菌 60 min 即得。 2 材料与方法 2.1 材料 2.1.1 仪器 Medlab 生物信号采集处理系统( 南京美易科技有限公司 )；动物人工呼吸机(DH 1 型，浙江医科大学医疗仪器实验厂)；心电图机(XDH3B 型，上海医用电 子仪器厂)。 2.1.2 药品与试剂 冠心丹参片(广州白云山和记黄埔中药有限公司)，乳酸脱氢酶(LDH)测试盒及肌 酸激酶(CK) 测试盒( 南京建成生物工程研究所 )，冠心丹参注射液本实验室自制 。 2.1.3 动物 昆明种小鼠 100 只，68 周龄，雌雄各半，体重 1822 g；健康成年 SD 大鼠 70 只，300350 g，雌雄各半(由辽宁医学院动物实验中心提供)。 2.2 方法 2.2.1 肌缺血再灌注模型制备 大鼠在麻醉下(乌拉坦 1.0 gkg-1，ip) 切开颈部皮肤，气管内插管，接人工呼吸 机，呼吸频率 5565min，潮气量 1.52 mL100 g-1，呼-吸时比为 1.25：1 ，压力在 0.491.47 kPa 之间。根据呼吸频率及深度调整呼吸参数。分离左、 右颈总动脉，左颈总动脉插入一含 0.1肝素生理盐水的 PE 管，另取一个充满 0.1肝素生理盐水的 PE 管经右颈总动脉插入左心室，根据显示器所示压力图 形改变判断插管是否进人心室腔。两导管均连压力换能器，分别将信号输入到 Medlab 生物信号采集处理系统，以监测大鼠血压和左心室血流动力学变化。观 察指标包括收缩压(SBP)、舒张压(DBP)和平均动脉压(MBP)、左心室收缩压(LV SP)、左心室等容期压力最大变化速率(dpdt)、左心室舒张压 (LVDP)、左心 室舒张末压(LVEDP) 、左心室发展压 (LVDP ，系 LVSP 与 LVEDP 的差值)、心 率(HR) 。将针式电极固定于大鼠四肢皮下，以监测肢体导联心电图变化。沿 胸骨左缘剪开 3，4，5 肋骨，暴露心脏，剪开心包膜。以左冠状动脉为标志， 用 38 圆 310 不锈钢圆针，在左冠状动脉下穿一 4-0 丝线。进针深度穿过心 肌 1 mm 左右，进出针问宽度在进出针间宽度在动脉周围 1.52 mm 左右。稳 定 15 min，待各指标稳定后记录药前心电图及血压等血流动力学各值。将一细 小 PE 管垫于血管与结扎线之间，拉紧结扎线使细小乳胶管压迫左冠状动脉而 致闭塞。以结扎后心脏局部发绀伴随 T 波高耸或 ST 段抬高，作为结扎成功的 标准。结扎 30 min 后，松开结扎线再灌注 90 min，以局部发绀逐渐变为红润 、心电图 ST 段逐渐恢复为再灌注成功的标志。在缺血期及再灌注期每隔 15 mi n 记录一次上述指标。每组 8 只，共 4 组：假手术组（Sham ）、溶剂对照组(IR) 、 冠心丹参片预处理组(Guanxin Danshen tablet)，冠心丹参注射液预处理组 (Guan xin Danshen injection)。假手术组不进行缺血再灌手术，灌胃等容积生理盐水 ；溶剂对照组进行缺血再灌手术，灌胃等容积生理盐水；冠心丹参片预处理组 灌胃冠心丹参片的悬浊液 150 mgkg，第 4 组为灌胃等容积生理盐水并肌肉注 射冠心丹参注射液 100 mg /kg，连续给药两周后进行手术。 2.2.2 血清 LDH 和 CK 活性测定 各组最后一次血流动力学指标测定后即从左颈总动脉取血约 1 mL，2 500 r/mi n，离心 15 min，得到大鼠血清，用 LDH 测试盒及 CK 测试盒分别测定。 2.2.3 电镜组织学观察 大鼠心肌缺血再灌注结束后，假手术组（Sham）、溶剂对照组 (IR)、冠心丹参 片预处理(Guanxin Danshen tablet)、冠心丹参注射剂预处理前 (Guanxin Danshen injection)组各取 2 鼠心脏，用锐利刀片取左室结扎线下与心尖部中点左心室壁 小块心肌，体积为 2 mm 2 mm 2 mm，用 4戊二醛处理，经脱水、包 埋、超薄切片，染色后在透射电镜下观察。 2.2.4 冠心丹参注射剂对夹闭小鼠气管心电图消失时间的影响 取小鼠 32 只，雌雄各半，体重 1822 g，平均体重(19.51.2) g，随机分为 4 组,每组 8 只，第 1 组小鼠灌胃等容积生理盐水，第 2 组灌胃给予冠心丹参片的 悬浊液 100 mgkg，第 3 组小鼠灌胃冠心丹参片的悬浊液 150 mgkg，第 4 组为灌胃等容积生理盐水并注射冠心丹参注射 100 mg /kg，每日灌胃，连续给 药两周，末次给药后 40 min，将小鼠用 1.5戊巴比妥钠 30 mgkg 腹腔注射 麻醉，仰位固定于小鼠解剖台上，四肢插入心电图针形电极，置心电监护仪下 ，观察标导联心电图。手术剪开小鼠颈部，分离气管，观察从夹闭小鼠气管 至小鼠心电图消失时间，所得数据用组间 t 检验，比较给药组与生理盐水对照 组之间的差异。 2.2.5 冠心丹参注射剂对小鼠常压耐缺氧的影响 取小鼠 32 只，雌雄各半，体重 1822 g，平均体重（19.61.2 ）g，随机分为 4 组，每组 8 只，第一组灌胃等容积生理盐水，第 2 组灌胃冠心丹参片的悬浊 液 150 mgkg，第 3 组灌胃冠心丹参片的悬浊液 100 mgkg。第 4 组灌胃生 理盐水，注射冠心丹参注射剂 100 mgkg，连续灌胃 14 d，末次给药后 40 mi n，将小鼠置于内装 200 mL 广口瓶内，瓶口涂抹凡士林，盖紧瓶盖，记录小鼠 装入瓶内盖紧瓶盖至小鼠停止呼吸的时间，即为小鼠常压耐缺氧时间，数据用 组间 t 检验。 2.2.6 对小鼠出血时间的影响 取小鼠 32 只，雌雄各半，体重 1822 g，平均体重（19.61.2） g，随机分为 4 组，每组 8 只，第一组灌胃等容积生理盐水，第 2 组灌胃冠心丹参片的悬浊 液 150 mgkg，第 3 组灌胃冠心丹参片的悬浊液 100 mgkg。第 4 组灌胃生 理盐水，注射冠心丹参注射剂 100 mgkg，连续给药 7 d，末次给药 12 h，用 毛细管法测定出血时间。 2.2.7 统计方法 采用单因与方差分析及 q 检验。 3 实验结果 3.1 见表 1。 表 1 冠心丹参注射液对大鼠缺血再灌注后左心室收缩压(LVSP)的影响注：与溶 剂对照组比较， P0.05 3.2 见表 2。 表 2 冠心丹参注射液对大鼠缺血再灌注后左心室舒张压(LVDP)的影响 注：与 溶剂对照组比较， P0.05 3.3 见表 3。 表 3 冠心丹参注射液对大鼠缺血再灌注后左心室等容期压力最大变化速率组别 注：与溶剂对照组比较， P0.05 3.4 见表 4。 表 4 冠心丹参注射液对大鼠缺血再灌注后左心室等容期压力最大变化速率 注 ：与溶剂对照组比较， P0.05 3.5 见表 5。 表 5 冠心丹参注射液对大鼠缺血再灌注后 乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶 (CK)活性的影响 注：与溶剂对照组比较， P0.05 3.6 电镜观察结果 假手术组心肌细胞膜完整，线粒体膜完整，嵴致密，基质颗 粒均匀(图 l A)。溶剂对照组细胞水肿，部分心肌细胞膜局部破裂；线粒体分布 紊乱、肿胀，外膜破损，嵴减少、排列紊乱、模糊不清、甚至断裂消失，基质 减少，线粒体内大片空化(图 1 B)。冠心丹参片 组心肌线粒体改变明显轻于溶 剂对照组，心肌细胞膜无破裂，肌原纤维完整有序；线粒膜完整，嵴致密，基 质密度变淡，局部出现空化区域(图 1 C)。冠心丹参注射剂 组心肌细胞膜无破 裂，肌原纤维完整有序；线粒体体膜完整，嵴致密，基质颗粒均匀(图 1 D)， 放大 20 000 倍。 A.假手术组;B.溶剂对照组;C.冠心丹参片对照组 ;D.冠心丹参 注射液对照组 图 1 电镜观察结果20 0003.7 见表 6。 表 6 冠心丹参注射液对小鼠出血时间的影响 （n=8，s ）组别时间/s 假手术组 43790.5 冠心丹参片预处理组 100 mgkg53378.2 冠心丹参片预处理组 150 mgkg53889.7 冠心丹参注射剂预处理组 100 mgkg58499.2 注：与溶剂对 照组比较， P0.05 3.8 见表 7。 表 7 冠心丹参注射液对夹闭小鼠气管 心电消失时间的影响 注：与溶剂对照组 比较， P0.05 3.9 见表 8。 表 8 冠心丹参注射液对小鼠耐缺氧 时间的影响 注：与溶剂对照组比较， P0.0 5 4 讨 论 本实验通过麻醉开胸后冠脉结扎造成 SD 大鼠缺血再灌注心肌损伤模型，从血 流动力学、生物化学和病理组织学上综合评价冠心丹参注射液对大鼠心肌的保 护用。结果表明，冠心丹参注射液 100 mgkg-1 预