江汉鸡蛋壳颜色色素分析及相关基因表达研究

-精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 1 江汉鸡蛋壳颜色色素分析及相关基 因表达研究 摘要：试验以白色、粉色、褐色 3 种蛋壳颜色的鸡蛋为研究材料，分析 色素在血液和蛋壳上的表现规律，检测 了相关候选基因在鸡器官中的表达情况。 结果表明，原卟啉含量的不同是造成褐 色鸡蛋蛋壳颜色深浅不一的主要因素， 脾脏可能是蛋壳色素原卟啉形成的重要 器官，CPOX 和 FCEH 基因可能是原卟 啉形成的关键基因，胆绿素沉积的相关 有机阴离子转运家族成员在原卟啉沉积 过程中无显著作用。 中国论文网 /8/view-12877002.htm 关键词：蛋壳颜色；原卟啉；候 选基因；江汉鸡 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 2 中图分类号：S831 文献标识码： A 文章编号： 0439-8114（2017）03- 0508-03 DOI：10.14088/ki.issn0439- 8114.2017.03.029 Study on Pigments of Eggshell Color and Candidate Genes Analysis of Jianghan Chicken SHEN Jie，ZHENG Chuan- wei，PAN Ai-luan，LIANG Zhen- hua，WU Yan，DU Jin-ping， ZHANG Hao，PU Yue-jin，PI Jin-song （Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science， Hubei Academy of Agricultural Sciences/The Animal Embryonic Engineering and Molecular Breeding Key Laboratory of Hubei， Wuhan 430064， China） Abstract： In present study， we used three different types of hens， i.e.， those laying eggs with a white shell， -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 3 pink shell （generated light-brown eggs） ， or brown shell，analyzed the regularity of the pigments between blood and eggshell，detected the expression of candidate genes in the organ of hens. We consider the content of protoporphyrin is the major reason of different eggshell color， a large number of protoporphyrin may produce in spleen. Maybe CPOX gene and FECH gene are the key of the protoporphyrin. But some organic anion transporting polypeptide family members do not have a significant effect as they play in biliverdin deposition. Key words： eggshell color； protoporphyrin； candidate genes； Jianghan chicken 江h 鸡是湖北江汉平原特有的 地方品种，具有黄鸡的普遍特征，产粉 壳或绿壳蛋，受到湖北及周边省份群众 的广泛欢迎。消费者对于绿壳和粉壳鸡 蛋的偏好，使研究鸡蛋壳颜色具有重要 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 4 的经济意义。众多的研究表明，造成禽 类蛋壳颜色不同的直接原因就是蛋壳表 面各种色素的含量不同，这些色素主要 是原卟啉、胆绿素和胆绿素的锌螯合物 1，2。鸡蛋的蛋壳颜色是可遗传的， 且遗传力较高，一般在 0.4 左右。虽然 遗传力较高，但不同品种间甚至同一品 种不同个体间所呈现的表型变异却很大 3-6。 在大多数后生动物中，-氨基乙 酰丙酸通过高度保守的八步反应合成血 红素，这一过程也称为谢明氏循环。血 红素生物合成的起始是甘氨酸和琥珀酰 辅酶 A 在 5-氨基乙酰丙酸合成酶 （ALAS）的作用下合成 -氨基乙酰丙 酸（ALA ） ；ALA 在 5-氨基乙酰丙酸聚 合酶（ALAD）的作用下聚合形成胆色 素原（PBG） ；PBG 在羟甲基胆素合成 酶（HMBS/PBGD）的作用下合成羟甲 基胆素（Hydroxymethylbilane） ；羟甲基 胆素在尿卟啉原合成酶（UROS）作 用下合成尿卟啉原 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 5 （Uroporphyrinogen ） ；尿卟啉原 在尿卟啉原脱羧酶（UROD）作用下生 成粪卟啉原（Coproporphyrinogen ） ； 粪卟啉原在粪卟啉原氧化酶 （CPOX）作用下合成原卟啉原 （Protoporphyrinogen ） ；原卟啉原 在原卟啉原氧化酶（PPOX）作用下 生成原卟啉（Protoporphyrin ） ；原 卟啉在亚铁螯合酶（FECH）的作用 下与 Fe2+结合最终形成血红素。在红 细胞分化过程中，CPOX 是血红素形成 的限速酶。 研究发现，绿壳蛋鸡的蛋壳颜色 是由一个主效基因决定的。Punnett 等7发 现并认为鸡 1 号染色体上的一个呈显性 的绿壳基因（Oocyan，O）作用导致了 绿色蛋壳。Bartlett 等8将该基因（O） 定位在鸡 1 号染色体的短臂上，发现其 与内源病毒因子（ALEV1）以及豆冠位 点（P）连锁，它们之间的遗传距离分 别为 1.8 cM（ev1 与 O 之间）和 4.1 cM（P 与 O 之间） 。Wang 等9研究发 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 6 现有机阴离子转运蛋白家族成员 SLCO1B3 与胆绿素在蛋壳上的沉积密 切相关，SLCO1B3 基因就是决定鸡产 绿壳蛋的关键基因。 但是关于褐壳（粉壳）鸡蛋的关 键控制基因的研究较少，尤其地方土鸡 的蛋壳颜色比褐壳白壳杂交后代更均匀 这一现象值得深入探讨。为此，本研究 在国家产业技术体系的支持下，选择白 来航、江汉鸡、洛岛红等蛋鸡品种，开 展关于江汉鸡蛋壳颜色的相关研究，以 期为更好地研究蛋壳颜色的形成机制提 供参考。 1 材料与方法 1.1 试验材料 试验鸡共分 3 组：白来航蛋鸡 （白壳蛋） 、洛岛红蛋鸡（褐壳蛋） 、江 汉鸡（粉壳蛋） ，每组选取产蛋鸡 30 只。 每只蛋鸡收集 3 枚所产蛋，翅静脉采血 1 mL，每 1 mL 血液用 20 U 肝素抗凝。 每组选取蛋壳颜色均一的 3 只母鸡，屠 宰后取子宫内壁组织样品，于 -80 保 存。所有蛋鸡均为 40 周龄，饲养条件 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 7 良好，无疾病发生，饲料中均未添加色 素成分。 1.2 试验方法 1）鸡蛋反光值测定。使用分光 测色计测定各组鸡蛋的反光值，记录相 关数据。 2）原卟啉与胆绿素标准曲线的 制作。取 0.36 g 原卟啉标准品和 0.26 g 胆绿素标准品，分别溶于溶解液（V 浓 盐酸V 甲醇=12）中，振荡混匀， 避光溶解 12 h，得到标准品原液；将原 液倍比稀释后用紫外分光光度计在 412 nm 和 670 nm 处测定各浓度标准品的吸 光值，制作原卟啉和胆绿素的标准曲线。 3）蛋壳中色素含量的测定。采 用 Ito 等10 的方法，蛋壳烘干后取 0.25 g 溶于溶解液中，静止溶解 12 h，12 000 r/min 离心 45 min，紫外分光光度计 在 412 nm 和 670 nm 处测定吸光值，比 照标准曲线，获得蛋壳中原卟啉和胆绿 素的含量。 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 8 4）红细胞中游离原卟啉含量的 y 定。每 20 L 抗凝血中添加 0.1 mL 生理盐水、4 mL 乙酸乙酯 -冰醋酸混合 液、2.5% 硅藻土 0.15 mL；将得到的混 合液涡旋振荡至充分混匀；高速离心 10 min 后取 3 mL 上清液，加入 4 mL 0.5 mol/L 的盐酸，混合 5 min 后取下层盐 酸溶液，测定吸光度；另取 0.03 mL 抗 凝血测定每个血样的红细胞体积；计算 每单位红细胞中游离原卟啉的相对含量。 5）RT-PCR 检测。运用 RT-PCR 方法检测血红素合成通路基因 CPOX、FECH 和有机阴离子转运家族 SLCO1B3 及其同家族基因 LOC418189 在不同蛋壳颜色蛋鸡子宫中的表达情况。 2 结果与分析 从表 1 可以看出，从表观上选取 的白色、粉色、褐色鸡蛋，其蛋壳反光 值具有极显著差异（P0.01） 。蛋壳中 色素原卟啉的含量和总量在 3 种鸡蛋中 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 9 差异显著（P0.05） ，且差异表现为从 白壳蛋到褐壳蛋原卟啉含量逐渐增多； 白壳蛋蛋壳中胆绿素的含量和总量均显 著低于粉壳蛋和褐壳蛋（P0.05） ；3 种 颜色蛋壳中色素总量差异极显著 （P0.01） ，其差异趋势表现为色素总 含量随着蛋壳颜色的加深而逐渐增多。 白壳蛋鸡红细胞中游离的原卟啉含量极 显著低于粉壳蛋鸡和褐壳蛋鸡 （P0.01） ，粉壳蛋鸡红细胞中游离的 原卟啉含量与褐壳蛋鸡红细胞中游离的 原卟啉含量无显著差异，但 3 种蛋鸡体 内红细胞中游离的原卟啉含量呈现出随 着蛋壳颜色的加深增多的趋势。 从表 2 可以看出，蛋壳的反光值 与蛋壳中原卟啉含量、蛋壳中原卟啉总 量和色素总量都呈极显著负相关；反光 值与蛋壳中胆绿素含量以及胆绿素的总 量无显著相关性。说明在褐色鸡蛋（包 括粉色和褐色两种）中，决定蛋壳颜色 的主要色素是原卟啉。 从图 1 和图 2 可以看出，白壳蛋 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 10 鸡肝脏和脾脏中的 CPOX mRNA 表达 量显著低于粉壳蛋鸡和褐壳蛋鸡， CPOX mRNA 在 3 种蛋鸡子宫部的表达 量差异不显著。白壳蛋鸡脾脏中 FECH mRNA 的表达量显著高于其他母鸡的脾 脏，FECH mRNA 在 3 种蛋鸡肝脏和子 宫中的表达差异不显著。CPOX 和 FECH 作为血红素合成通路的上下游关 键酶，其在脾脏中的表达结果与蛋壳颜 色的变化趋势相符合，证明了蛋壳表面 的色素原卟啉是来自于血红素合成通路， 脾脏可能是作为蛋壳表面原卟啉来源的 一个关键组织，CPOX 和 FECH 基因可 能是原卟啉合成暨导致蛋壳表面颜色差 异的关键基因。SLCO1B3 和 LOC418189 基因在不同蛋鸡的子宫部位 不存在明显的表达差异，对照蛋鸡绿壳 基因的相关研究结果，认为在胆绿素沉 积过程中起关键作用的 SLCO1B3 基因 对于原卟啉的沉积不存在积极作用。 3 小结 试