GB 5009.82-2016 食品安全国家标准 食品中维生素A、D、E的测定

016食品安全国家标准食品中维生素A、D、016 前 言本标准代替003食品中维生素010食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中维生素A、D、008肉与肉制品 维生素008肉与肉制品 维生素15982008食用植物油中维生素效液相色谱法。本标准与003相比,主要变化如下:标准名称修改为“食品安全国家标准 食品中维生素A、D、增加了“食品中维生素相高效液相色谱法”;增加了“食品中维生素相色谱增加了“食品中维生素效液相色谱法”;修改了“食品中维生素相高效液相色谱法”;修改了维生素同时分离测定4种生育酚异构体;删除了苯并芘内标定量法,改用外标法定量;删除了“比色法”测定维生素A。0161 食品安全国家标准食品中维生素A、D、围本标准规定了食品中维生素A、维生素标准第一法适用于食品中维生素标准第二法适用于食用油、坚果、豆类和辣椒粉等食物中维生素标准第三法适用于食品中维生素标准第四法适用于配方食品中维生素一法 食品中维生素相高效液相色谱法2 原理试样中的维生素淀粉先用淀粉酶酶解)、提取、净化、浓缩后,外检测器或荧光检测器检测,外标法定量。3 试剂和材料除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为6682规定的一级水。水乙醇(经检查不含醛类物质, 抗坏血酸(氧化钾(醚(O:经检查不含过氧化物, 石油醚(沸程为3060。水硫酸钠( 4)。醇(色谱纯。粉酶:活力单位100U/0 2,615简称氧化钾溶液(50g/100g):称取50入50却后,储存于聚乙烯瓶中。油醚+1):量取200入200匀。0162 机系过滤头(生素208纯度95%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。290191纯度95%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。2848纯度95%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。284纯度95%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。2719纯度95%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。生素无水乙醇溶解后,转移入50容至刻度,溶液转移至棕色试剂瓶中,密封后,在避光保存,有效期1个月。临用前将溶液回温至20,并进行浓度校正(校正方法参见附录B)。生素分别准确称取无水乙醇溶解后,转移入50容至刻度,溶液转移至棕色试剂瓶中,密封后,在避光保存,有效期6个月。临用前将溶液回温至20,并进行浓度校正(校正方法参见附录B)。生素甲醇定容至刻度,生素避光保存,有效期半个月。生素甲醇定容至刻度,用前配制。4 析天平:温水浴振荡器。转蒸发仪。吹仪。外分光光度计。液漏斗萃取净化振荡器。0163 效液相色谱仪:带紫外检测器或二极管阵列检测器或荧光检测器。5 样制备将一定数量的样品按要求经过缩分、粉碎均质后,储存于样品瓶中,避光冷藏,尽快测定。样处理警示:使用的所有器皿不得含有氧化性物质;分液漏斗活塞玻璃表面不得涂油;处理过程应避免紫外光照,尽可能避光操作;提取过程应在通风柜中操作。含淀粉样品称取2g5g(均质处理的固体试样或50g(体试样于150体试样需加入约20匀,匀,加入30入100加边振摇,混匀后于80恒温水浴震荡皂化30化后立即用冷水冷却至室温。注:皂化时间一般为30皂化液冷却后,液面有浮油,需要加入适量氢氧化钾溶液,并适当延长皂化时间。淀粉样品称取2g5g(均质处理的固体试样或50g(体样品于150体试样需用约20入60水浴避光恒温振荡30出,匀,加入3000加边振摇,混匀后于80恒温水浴振荡皂化30化后立即用冷水冷却至室温。取将皂化液用30入50荡萃取5下层溶液转移至另一250入50并醚层。注:如只测维生素用石油醚作提取剂。涤用约100需重复3次,直至将醚层洗至中性(可用去除下层水相。缩将洗涤后的醚层经无水硫酸钠(约3g)滤入250约15入蒸发瓶内,并将其接在旋转蒸发仪或气体浓缩仪上,于40水浴中减压蒸馏或气流浓缩,待瓶中醚液剩下约2下蒸发瓶,立即用氮气吹至近干。用甲醇分次将蒸发瓶中残留物溶解并转移至10容至刻度。0164 谱参考条件色谱参考条件列出如下:a) 色谱柱:长250径3m),或相当者;b) 柱温:20;c) 流动相:A:水;B:甲醇,洗脱梯度见表1;d) 流速:e) 紫外检测波长:维生素生素f) 进样量:10L;g) 1:如难以将柱温控制在202,可改用动相为水和甲醇梯度洗脱。注2:如样品中只含需分离选用动相为甲醇。注3:如有荧光检测器,可选用荧光检测器检测,对生育酚的检测有更高的灵敏度和选择性,可按以下检测波长检测:维生素射波长440生素射波长3281 动相B%流速mL/准曲线的制作本法采用外标法定量。将维生素定相应的峰面积,以峰面积为纵坐标,以标准测定液浓度为横坐标绘制标准曲线,计算直线回归方程。品测定试样液经高效液相色谱仪分析,测得峰面积,采用外标法通过上述标准曲线计算其浓度。在测定过程中,建议每测定10个样品用同一份标准溶液或标准物质检查仪器的稳定性。6 分析结果的表述试样中维生素)计算:X=Vf100m(1)式中:X 试样中维生素生素g/100g),维生素00g);根据标准曲线计算得到的试样中维生素位为微克每毫升(g/0165 V定容体积,单位为毫升(f换算因子(维生素A:f=1;维生素E:f=100试样中量以每100克计算的换算系数;m试样的称样量,单位为克(g)。计算结果保留三位有效数字。注:如维生素示,可按下式计算:维生素E(00g)=00g)+00g)00g)00g) 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。8 其他当取样量为5g,定容10生素00g,定量限为30g/100g;生育酚的紫外检出限为40g/100g,定量限为120g/100g。第二法 食品中维生素相高效液相色谱法9 原理试样中的维生素缩后,用高效液相色谱酰氨基柱或硅胶柱分离,经荧光检测器检测,外标法定量。10 试剂和材料除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯。水为6682规定的一级水。水乙醇(色谱纯,经检验不含醛类物质,醚(O:分析纯,经检验不含氧化物,油醚(沸程为3060。水硫酸钠(己烷(色谱纯。丙醇(色谱纯。丁基甲基醚:色谱纯。醇(色谱纯。氢呋喃(色谱纯。,44色谱纯。,615简称机系过滤头(0166 油醚+1):量取200入200匀,临用前配制。动相:正己烷+叔丁基甲基醚0+1+=90+10,临用前配制。290191纯度95%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质;2848纯度95%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质;284纯度95%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质;2719纯度95%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。生素用无水乙醇溶解于50容至刻度,溶液转移至棕色试剂瓶中,密封后,在避光保存,有效期6个月。临用前将溶液回温至20,并进行浓度校正(校正方法参见附录B)。生素氮气吹除乙醇后,用流动相定容至刻度,封后,在避光保存,有效期半个月。生素流动相定容至刻度,1 仪器和设备 析天平:温水浴振荡器。转蒸发仪。吹仪。外分光光度计。氏脂肪抽提仪或加速溶剂萃取仪。效液相色谱仪,带荧光检测器或紫外检测器。12 样制备将一定数量的样品按要求经过缩分、粉碎、均质后,储存于样品瓶中,避光冷藏,尽快测定。0167 样处理警示:使用的所有器皿不得含有氧化性物质;分液漏斗活塞玻璃表面不得涂油;处理过程应避免紫外光照,尽可能避光操作。25入10流动相定容至刻度,摇匀。进样。油、黄油称取2g5505水浴融化,加入5旋1匀,加入25心,将上清液转移至浓缩瓶中,再用20并上清液至浓缩瓶,在旋转蒸发器或气体浓缩仪上,于45水浴中减压蒸馏或气流浓缩,待瓶中醚剩下约2下蒸发瓶,立即用氮气吹干。用流动相将浓缩瓶中残留物溶解并转移至10容至刻度,摇匀。果、豆类、辣椒粉等干基植物样品称取2g5用索氏提取仪或加速溶剂萃取仪提取其中的植物油脂,将含油脂的提取溶剂转移至25040水浴中减压蒸馏或气流浓缩至干,取下蒸发瓶,用10声或涡旋振荡溶解后,用流动相定容至刻度,摇匀。进样。谱参考条件色谱参考条件列出如下:a) 色谱柱:酰氨基柱(柱长150相当者;b) 柱温:30;c) 流动相:正己烷+叔丁基甲基醚0+1+=90+10;d) 流速:e) 荧光检测波长:激发波长294射波长328nm;f) 进样量:10L。注:可用长250径5m)分离4种生育酚异构体,推荐流动相为正己烷与1,45+5)的比例混合。准曲线的制作本法采用外标法定量。将维生素定相应的峰面积。以峰面积为纵坐标,标准溶液浓度为横坐标绘制标准曲线,计算直线回归方程。品测定试样液经高效液相色谱仪分析,测得峰面积,采用外标法通过上述标准曲线计算其浓度。在测定过程中,建议每测定10个样品用同一份标准溶液或标准物质检查仪器的稳定性。0168 13 分析结果的表述试样中)计算:X=Vf100m(2)式中:X 试样中位为毫克每百克(00g);根据标准曲线计算得到的试样中位为微克每毫升(g/V定容体积,单位为毫升(f换算因子(f=100试样中量以每百克计算的换算系数;m试样的称样量,单位为克(g)。计算结果保留三位有效数字。注:如维生素示,可按下式计算:维生素E(00g)=00g)+00g)00g)00g)4 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。15 其他当取样量为2g,定容25生育酚的检出限为50g/100g,定量限为150g/100g。第三法 食品中维生素相色谱理试样中加入维生素氢氧化钾乙醇溶液皂化(含淀粉试样先用淀粉酶酶解)、提取、硅胶固相萃取柱净化、浓缩后,反相高效液相色谱联质谱法检测,内标法定量。17 试剂和材料除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯。水为6682规定的一级水。水乙醇(色谱纯,经检验不含醛类物质,坏血酸(,615简称0169 粉酶:活力单位100U/氧化钾(酸乙酯(色谱纯。己烷(色谱纯。水硫酸钠( 4)。相萃取柱(硅胶):600醇(色谱纯。酸(色谱纯。酸铵(色谱纯。氧化钾溶液(50g/100g):50入50却后储存于聚乙烯瓶中。酸乙酯+95):量取5匀。酸乙酯5+85):量取15匀。酸甲酸铵溶液:000声混匀。酸甲酸铵甲醇溶液:000声混匀。生素化醇(0纯度98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。生素钙化醇(11纯度98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。生素28100g/生素27100g/生素色谱纯无水乙醇溶解并定容至100其浓度约为100g/移至棕色试剂瓶中,于箱中密封保存,有效期3个月。临用前用紫外分光光度法校正其浓度(校正方法见附录B)。生素色谱纯无水乙醇溶解并定容至10其浓度约为100g/移至100箱中密封保存,有效期3个月。临用前用紫外分光光度法校正其浓度(校正方法见附录B)。生素流动相稀释并定容至100效期1个月。准确浓度按校正后的浓度折算。生素流动相稀释并定容至100效期1个月。准确浓度按校正后的浓度折算。生素流动相稀释并定容至100效期1个月。生素别量取100甲醇定容,配制成1g/01610 期1个月。甲醇定容至刻度,混匀。、100g/L、150g/L、200g/L。18 仪器和设备注:使用的所有器皿不得含有氧化性物质。分液漏斗活塞玻璃表面不得涂油。析天平:力搅拌器或恒温振荡水浴:带加热和控温功能。转蒸发仪。吹仪。外分光光度计。取净化振荡器。功能涡旋振荡器。速冷冻离心机:转速6000r/效液相色谱电喷雾离子源。19 样制备将一定数量的样品按要求经过缩分、粉碎、均质后,储存于样品瓶中,避光冷藏,尽快测定。样处理注:处理过程应避免紫外光照,尽可能避光操作。含淀粉样品称取2g(均质处理的试样于50入6水,涡旋1入12旋30s,再加入6旋300避光恒温水浴振荡30样品组织较为紧密,可每隔5取出放入冷水浴降温。注:一般皂化时间为30皂化液冷却后,液面有浮油,需要加入适量氢氧化钾溶液,并适当延长皂化时间。淀粉样品称取2g(均质处理的试样于50入10水,放入恒温振荡器中,60避光恒温振荡30出放入冷水浴降温,2旋30s,再加入6旋3001611 取向冷却后的皂化液中加入20旋提取3000r/移上层清液到50入25微晃动30次,在6000r/上层有机相备用。化将硅胶固相萃取柱依次用8备用液全部过柱,再用6+95)淋洗,用65+85)洗脱。洗脱液在40下氮气吹干,旋30s,谱参考条件色谱参考条件列出如下:a) 长100或相当者;b) 柱温:40;c) 流动相A:酸甲酸铵溶液;流动相B:酸甲酸铵甲醇溶液;流动相洗脱梯度见表2;d) 流速:e) 进样量:10L。表2 流动相洗脱梯度时间动相B%流速(mL/谱参考条件质谱参考条件列出如下:a) 电离方式:b) 鞘气温度:375;c) 鞘气流速:12L/01612 d) 喷嘴电压:500V;e) 雾化器压力:172f) 毛细管电压:4500V;g) 干燥气温度:325;h) 干燥气流速:10L/i) 多反应监测(式。锥孔电压和碰撞能量见表3,3 维生素m/z)定性子离子(m/z)碰撞电压m/z)准曲线的制作分别将维生素维生素生素维生素生素生素品测定将待测样液依次进样,得到待测物与内标物的峰面积比值,根据标准曲线得到测定液中维生素生素测样液中的响应值应在标准曲线线性范围内,0 分析结果的表述试样中维生素生素)计算:X=Vf100m(3)式中:X 试样中维生素维生素含量,单位为微克每百克(g/100g);根据标准曲线计算得到的试样中维生素维生素浓度,单位为微克每毫升(g/V定容体积,单位为毫升(f稀释倍数;100试样中量以每100克计算的换算系数;01613 m试样的称样量,单位为克(g)。计算结果保留三位有效数字。注:如试样中同时含有维生素生素1 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。22 其他当取样量为2生素00g,定量限为3g/100g;00g;00g。第四法 食品中维生素效液相色谱法23 原理试样中的维生素淀粉试样先用淀粉酶酶解)、提取、净化、浓缩后,用正相高效液相色谱半制备,反相高效液相色谱紫外或二极管阵列检测器检测,内标法(或外标法)定量。如测定维生素用维生素测定维生素用维生素4 试剂和材料除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯。水为6682规定的一级水。水乙醇(色谱纯,经检验不含醛类物质,坏血酸(,615简称氧化钾(己烷(油醚(沸程为3060。水硫酸钠( 4)。醇:色谱纯。粉酶:活力单位100U/氧化钾溶液:50入50却后储存于聚乙烯瓶中,临用前配制。己烷+1):量取8匀,超声脱气,备用。醇5+1):量取50匀,超声脱气,备用。01614 生素化醇(0纯度98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。生素钙化醇(11纯度98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。生素色谱纯无水乙醇溶解并定容至100其浓度约为100g/移至棕色试剂瓶中,于箱中密封保存,有效期3个月。临用前用紫外分光光度法校正其浓度(校正方法参见附录B)。生素色谱纯无水乙醇溶解并定容至100其浓度约为100g/移至100箱中密封保存,有效期3个月。临用前用紫外分光光度法校正其浓度(校正方法参见附录B)。生素流动相稀释并定容至100效期1个月,准确浓度按校正后的浓度折算。生素流动相稀释并定容至100效期3个月,准确浓度按校正后的浓度折算。生素流动相稀释并定容至100确浓度按校正后的浓度折算。生素流动相稀释并定容至100确浓度按校正后的浓度折算。准系列溶液的配制:用维生素甲醇定容至刻度混匀。用维生素甲醇定容至刻度,混匀。5 仪器和设备注:使用的所有器皿不得含有氧化性物质。分液漏斗活塞玻璃表面不得涂油。析天平:力搅拌器:带加热、控温功能。转蒸发仪。吹仪。外分光光度计。取净化振荡器。制备正相高效液相色谱仪:带紫外或二极管阵列检测器,进样器配500相高效液相色谱分析仪:带紫外或二极管阵列检测器,进样器配10001615 26 样制备将一定数量的样品按要求经过缩分、粉碎、均质后,储存于样品瓶中,避光冷藏,尽快测定。样处理处理过程应避免紫外光照,尽可能避光操作。如样品中只含有维生素用维生素只含有维生素用维生素则,用外标法定量,但需要验证回收率能满足检测要求。含淀粉样品称取5g10g(均质处理的固体试样或50g(体样品于150体试样需加入200测定维生素维生素测定维生素维生素,匀。加入30入100加边振摇,混匀后于恒温磁力搅拌器上80回流皂化30化后立即用冷水冷却至室温。注:一般皂化时间为30皂化液冷却后,液面有浮油,需要加入适量氢氧化钾乙醇溶液,并适当延长皂化时间。淀粉样品称取5g10g(均质处理的固体试样或50g(体样品于150体试样需加入约20测定维生素维生素测定维生素维生素1入60恒温水浴振荡30匀。加入3000加边振摇,混匀后于恒温磁力搅拌器上80回流皂化30化后立即用冷水冷却至室温。取将皂化液用30入50荡萃取5下层溶液转移至另一250入50并醚层。涤用约150需重复3次,直至将醚层洗至中性(可用去除下层水相。缩将洗涤后的醚层经无水硫酸钠(约3g)滤入250约15入蒸发瓶内,并将其接在旋转蒸发器或气体浓缩仪上,于40水浴中减压蒸馏或气流浓缩,待瓶中醚剩下约2下蒸发瓶,氮吹至干,用正己烷定容至2化待测液。01616 制备正相高效液相色谱参考条件半制备正相高效液相色谱参考条件列出如下:a) 色谱柱:硅胶柱,柱长250径5m,或具同等性能的色谱柱;b) 流动相:环己烷+正己烷(1+1),入异丙醇;c) 流速:1mL/d) 波长:264nm;e) 柱温:351;f) 进样体积:500L。402的氮吹仪上吹干。残渣用10该溶液100定维生素后将500据维生素试管置于40水浴氮气吹干,渣振荡溶解,即为维生素相液相色谱参考条件反相液相色谱参考条件列出如下:a) 色谱柱:长250径5m,或具同等性能的色谱柱;b) 流动相:甲醇+水=95+5;c) 流速:1mL/d) 检测波长:264nm;e) 柱温:351;f) 进样量:100L。准曲线的制作分别将维生素到维生素两者峰面积比为纵坐标,以维生素品测定吸取维生素到待测物与内标物的峰面积比值,根据标准曲线得到待测液中维生素维生素浓度。27 分析结果的表述试样中维生素维生素含量按式(4)计算:X=Vf100m(4)01617 式中:X 试样中维生素维生素含量,单位为微克每百克(g/100g);根据