植物转基因技术原理及要点

植物转基因技术原理及要点李琳玲1.技术路线目的基因分离 植物表达载体的构建受体材料的准备遗传转化转化组织组织脱分化转化植株筛选炼苗1.目的基因的分离v （ 1）已知基因的获得v 化学合成法v PCR扩增v （ 2）未知基因的获得v 构建基因组文库，筛选目的基因v 构建 cDNA文库，筛选目的基因v mRNA差异显示技术筛选差异表达基因v 差异蛋白质谱表达技术筛选功能基因v pGEM-T 银杏叶银杏叶 RNA提取提取 反转录 cDNA chs全长 cDNA的克隆 TA克隆及测序 向 chs两端引入酶切位点 双酶切 定向克隆 导入农杆菌2.植物表达载体的构建例 pBI121-chs构建pBI121图谱银杏 chs基因植物表达载体构建示意图chs-glucuronidose NOS ter CaMV35P chs3.受体材料的准备v细胞的全能性：分化细胞脱分化 再分化4.遗传转化v（ 1）间接转化法 农杆菌介导转化法 v（ 2）直接转化法v A、 基因枪转化法v B、 电击法v C、花粉管通道法v D、 PEG介导基因转化法v根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens),是一种革兰氏阴性土壤杆菌 ,它含有 Ti质粒 ,能诱导被侵染的植物细胞形成肿瘤 ,即诱发冠瘿瘤 .Ti质粒 (包括 Ri质粒 )上有一段转移DNA,在农杆菌侵染宿主植物时 ,这段 DNA可以转移进植物细胞 ,并稳定地保留在植物细胞染色体中,变为植物细胞新增加的一群基因 ,最终能通过有性世代遗传给子代 。返 回v基因枪转化法由美国 Cornell大学的Sanfor (1987)提出 ,它的主要原理是将包含目的基因的载体包被在微小的金属微粒 (钨粒或金粒 )表面 ,通过高压驱动力加速微粒穿透植物细胞壁 ,导入受体组织细胞内 ,然后通过组织培养再生出完整的植株 .微粒上的外源 DNA进入细胞后 ,整合到染色体上并得到表达 ,从而实现基因的转化 .。返 回v电击法的主要原理是将原生质体在溶液中与 DNA混合 ,然后利用高压电脉冲作用 ,使原生质体膜的某些部位被击穿而产生可回复的小孔 ,外源 DNA可通过小孔进入原生质体内 ,而且不影响经电击处理的原生质体再生植物的能力 . 返 回 v花粉管通道法是利用开花植物授粉后形成的花粉管通道 ,直接将外源目的基因导入尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞 ,实现目的基因转化 . 返 回vPEG介导基因转化的主要原理是聚乙二醇(PEG)、多聚 -L-鸟核苷酸 (pLO)、磷酸钙及高pH值条件下诱导原生质体摄取外源 DNA分子.PEG可促使细胞膜与 DNA间接触与粘连 ,并通过引起膜表面电荷的紊乱及干扰细胞间的识别 ,利于细胞膜间的融合以及外源 DNA进入原生质体 . 返 回表 1 几种植物转基因方法比较转 基因方法 转 化的 优 点 转 化的缺点DNA间 接 转 化法农 杆菌介 导 基因转 移受体种 类 ，可以在原生 质 体、蛋 细 胞和 细 胞 团 、 组织 器官或整株等多 级 水平上 进 行，方法成熟可靠， 简 便易行，周期短， 转 化率高；转 化双子叶植物 为 主。大多数 单 子叶植物和裸子植物 对农 杆菌的侵入不敏感，限制了 该 法在禾谷 类 作物中的 应 用。转 化体常出 现 “嵌合 ”现 象，需在 严 格条件下加以 选择 以淘汰未 转 化 细 胞DNA直接 转 化法（ 1）基因 枪转 化法（ 2） 电击 法（ 3） PEG介 导 基因 转 化法（ 4）花粉管通道法无宿主限制，适用于各种 单、双子叶植物，操作 简单转 化效率低，需要 专门设备 （ 电击仪 、 显 微操作 仪 或基因 枪 ），多数需要原生 质 体与愈 伤组织，周期太 长 （ 电击 法）5.转化组织 农杆菌介导之叶盘转化法带有转化基因的农杆菌活化受体植物叶盘侵染共培养筛选培养诱导成苗预培养叶盘，或愈伤组织遗传转化主要的影响因素：1.预培养时间：一般 03天，过长不利于侵染2.农杆菌浓度：用 MS（ pH=7.0）盐溶液调 OD值（一般在 0.21.0）3.侵染时间：时间应适中，太短转化率低；太高则后期农杆菌难以除净，毒害材料。4.共培养时间5.乙酰丁香酮（ AS）处理：处理方式及浓度(A) 仅共培养基中加 AS(B) 仅菌液中加 AS(C) 菌液和共培养基中均加 ASAS使用浓度： 50M200M实验结论： A与 C效果最好且差异不明显6.炼苗7.转基因苗的筛选与鉴定培养过程中利用标记基因筛选标记基因选择标记基因 (Slective gene)报告基因 (Report gene)抗生素类选择基因抗除草剂类选择基因生物安全性标记类选择基因-D-葡萄糖酸苷酶基因 (Gus)荧光素酶基因 (Luc)氯霉素乙酰转移酶基因 (Cat)绿色荧光蛋白基因 (Gfp)例 Gus检测原理： 葡萄糖酸苷酶基因（ Gus），催化 葡萄糖苷酯类物质水解。其中很多水解产物具有发色团或形成荧光物质。例：组织化学法测定 Gus活性作用底物为 X-gluc,产物是一种不可溶的 5,5-二溴， 4,4-二氯靛蓝；转基因植物的 PCR检测外源基因整合的 PCR-Southern杂交检测外源基因拷贝的 IPCR检测外源基因表达的 RT