免疫组织化学检验技术.ppt

1、免疫学检测，第二十二章免疫组织化学检测技术，免疫组织化学检测技术，也称为免疫细胞化学检测技术，是利用标记特异性抗体(或抗原)和组织细胞内抗原(或抗体)的抗原抗体反应和组织化学呈色反应，对组织和细胞抗原进行定性、定位、定量检测的免疫检测方法。 免疫组化检测原理，免疫组化检测原理，免疫组化检测原理，第一节免疫组化检测技术基本知识，免疫组化全过程，一、标本制作，标本制作得到良好的免疫细胞组化分析保障，良好的细胞和组织学结构有助于抗原的正确显示和定位。 (1)标本的主要来源为：生物组织的各种体液和穿刺液培养细胞等；(2)标本的固定和保存1防止组织材料的固定目的组织细胞死后的变化，为了保持其固有形态，将

2、细胞内的蛋白质等各种抗原成分转换为不溶性物质，用原来的结构使组织中的各种物质沉淀凝固，产生不同的折射率，染色后， 固定剂的鉴别和观察容易兼顾硬化作用，使组织硬化，使细胞过度收缩或膨胀，失去原来的形态结构，使固定的组织对染料有不同的亲和力着色清晰，容易识别。 2固定剂的选择最佳固定剂最大限度保持基准细胞和组织形态结构抗原的免疫活性3固定方法固定方法常用浸渍法主要适用于活检和手术标本及其他不能灌注的组织固定。 灌注法适用于动物实验研究。 (3)玻璃板处理玻璃板的处理是进行免疫组化染色的重要步骤之一，一般需要在免疫组化玻璃板上涂抹一定的胶粘剂，常用的切片胶粘剂有树脂膏、聚赖氨酸和防脱片剂(4)的切片

3、方法的选择，二、抗原处理(1) 进行抗原暴露和修复的原因1 .固定液的影响2 .抗体调制的影响(2)抗原的暴露主要通过酶消化的方法选择酶消化时，根据显示的抗原成分选择不同的酶在日常业务中用胰蛋白酶消化即可，(3)热诱导的抗原修复抗原修复可以将通常的固定残奥翅切片高温、 高压下抗原修复提高抗原抗体的阳性检出率微波处理法水浴法压力锅法，三、抗体处理、抗体是免疫组织化学技术第一试剂(一)选择抗体需要特异性和稳定性较高的优质抗体(二)抗体稀释抗原抗体反应所需的适当比例，但过量或不足也是值得期待的(三) 合理保存抗体应特别注意保持抗体生物活性，四、常用标记物，(一)荧光素酶：异硫氰酸荧光素酶、四乙基罗丹

4、明等(二)酶：辣根过氧化物酶(HRP ) (三)生物素(1)对照染色设置修订免疫组织化学染色的1 .阳性对照已知抗原阳性切片和受检体同时免疫组化染色。 目的验证所用免疫组化染色工艺的有效性，排除假阴性的可能性。 2 .阴性对照以确认不含已知抗原的标本为对照，呈阴性结果，称为阴性对照。 目的是排除假阳性。 3、阴性试剂对照是为验证免疫组化染色使用的试剂(特别是特异性抗体试剂的有效性和可靠性)而建立的同时免疫染色对照，包括空白对照、替代对照、吸收试验和抑制试验等。 4 .自我对照是指同一标记切片上自我组织成分的阴性背景对照。(二)阳性结果阳性细胞的发色是细胞膜、细胞质和细胞核的免疫发色强度和阳性细

5、胞密度定性，定量指标可以阳性细胞的着色形态(如细胞膜型、细胞核型、细胞质(浆)型等)和组织分布特征(如局部型、弥漫型、切片型等) (四) 特异性发色和非特异性发色的鉴别1 .分布位置特异性反应必须分布在特定抗原部位非特异性反应没有一定的分布规律，2 .发色强度特异性反应根据细胞内抗原含量而发色强度不同。 阳性细胞的染色常定位于细胞，与阴性细胞之间有明显的间隔，非特异性染色常局限于单个细胞，常为片状细胞3。 此外，对于过大的组织块，中心固定不良也会引起非特异性显色，六、质量控制是免疫组织化学检测技术取得满意结果的必要条件。 (1)试剂质量控制抗体的质量是免疫组织化学染色成功的关键；(2)操作过程

6、质量控制实验操作标本的质量控制；(3)仪器设备和仪器的质量控制，第二节酶无组织化学检测技术，酶无组织化学检测技术在一定条件下，也可以通过应用酶标准抗体(抗原)和组织或细胞标本中的抗原(抗体)的影像解析技术达到定量的目的。 一、标本制备、常用标本为组织切片、组织印迹和细胞涂片酶无组织化学检测技术在酶标记抗体免疫组织化学染色法非标记抗体酶免疫组织化学染色法、二、酶标记抗体免疫组织化学染色法、(一)原理酶标记抗体免疫组织化学染色法通过交联剂的共价键作用来抗体(或抗抗体)酶直接结合的酶标记抗体(或抗抗体)与组织内特异抗原或抗原抗体复合物反应后，通过酶对基质的催化作用，生成不溶性有色物质，沉淀在特定位置

7、，从而达到抗原的定性、定位、定量检测的目的。 (二)技术类型1 .直接法形成抗原一抗体一酶复合物2 .间接法形成Ag-Ab1-Ab2E复合物3 .酶标记抗体三阶段染色法评价间接法改良法形成Ag-Ab1-Ab2E-Ab3E复合物(三)方法，制备效价高且特异性强的抗酶抗体(Ab3 )； (2)技术类型1 .酶桥法西洋山葵过氧化物酶(HRP )，Ab2可以与Ab3的Fc段结合，与结合到组织抗原上的第一抗体(Ab1 )的Fc段结合，经过酶Ab1 (兔抗相应组织抗原的抗体为2.PAP法)过氧化物酶(P)-抗过氧化物酶(AP )法是一种改进的酶桥法，用于制备抗HRP的抗体(Ab3 )，桥接Ab2 (例如羊

8、抗兔)，并与组织抗原结合用桥抗体(Ab2 )连接特异性识别组织抗原的抗体(Ab1 )和PAP复合体的抗酶抗体， 3 .双桥PAP法该方法是PAP法的改进，通过桥抗体和PAP两次连接形成agab 1a B2 pap4. APAAP法APA AP法是用碱性磷酸酶代替HRP建立的碱性磷酸酶(AP )抗碱技术要点与PAP法相似。 (3)方法评价该技术能检测抗原和抗体两者。 酶不是在抗体上标记，而是通过抗原(酶)抗体反应与抗酶抗体结合，避免了酶标记抗体的缺陷，提高了方法的敏感性。 特别是双桥PAP法，是目前免疫组化技术中感受性较高的方法。 四、临床应用、酶联免疫组化检测技术主要用于组织切片或其他抗原的定

9、性、定位、定量检测。 可检测组织切片中的各种抗原性物质，如各种蛋白质、酶、激素、细胞、病毒、肿瘤抗原、浆细胞中的免疫球蛋白、各种多肽、细胞表面标记等。 第三节荧光免疫组织化学检测技术利用抗原抗体特异性结合的原理，首先用荧光素标记已知的抗体，以此为探针检测细胞或组织内对应抗原，在荧光显微镜下观察。 抗原抗体复合物中荧光素受激发光照射时，会发出一定波长的荧光，对组织中的某些抗原进行定性、定位和定量分析。 一、制作标本，常见的临床标本材料主要有组织、细胞和细菌三种，可根据标本的性质制作涂膜、板块或组织切片等。 (1)载玻片和盖玻片的处理载玻片和盖玻片薄、均匀、清洁、透光性好；(2)切片1组织切片组织

10、材料可制作冻结切片或残奥片切片。 2板组织材料也可以是板。 3涂膜细胞或细菌要制成涂膜，涂膜必须薄而均匀。 (3)标本的固定主要目的是：1.防止细胞和切片从玻璃板脱落2 .去除妨碍抗原抗体结合的脂质3 .易于保存。 除活细胞外，其他标本在染色前必须用适当的方法固定。 (四)标本片保存固定的标本片应尽快荧光染色检查，需要保存时用-20低温干燥保存。 二、荧光抗体标记及染色、荧光抗体是荧光免疫技术的关键试剂，荧光素与特异性抗体以共价键方式结合在一起。 其制备过程通常包括抗体标记、纯化和鉴定三个步骤。 在固定标本上滴加适当稀释的荧光抗体，装入带盖湿箱，温育37分钟30分钟。 检测耐热抗原最好是4夜。

11、 温育后，充分清洗、干燥、镜检。 三、临床应用，1 .应用于自身免疫性疾病2 .各种病原微生物快速检测和鉴定3 .寄生虫感染的诊断4 .除白细胞分化抗原检测外，还应用于HLA、肿瘤组织中的肿瘤抗原、组织中的免疫球蛋白和补体成分、激素和酶的定位等。 第四节亲和组织化学检测技术、亲和组织化学是利用两种物质之间高亲和度建立的方法之一。 生物素、葡萄球菌a蛋白、植物肝素等具有二价或多价结合力的物质，对某种组织成分具有高亲和性，与蛋白质、糖类、荧光素酶和酶等多种大小分子结合形成相应的复合体，利用荧光显微镜、酶基质的显色反应等技术， 在细胞或亚细胞水平进行亲和物质定位、定性或定量的亲和组织化学中使用的物质

12、有生物素和抗生物素蛋白、植物凝集素和糖类、SPA和IgG、链霉生物素蛋白和生物素等。 一、生物素-亲和素法，生物素可以与蛋白质、糖类、酶等多种大小的分子生物素化形成。 抗生物素蛋白也称为抗生物素蛋白，各自的抗生物素蛋白分子有生物素键的4个部位，两者可以牢固地结合成不可逆的复合体。1 .标记亲和素生物素法(LAB法)可以将亲和素与标记物(HRP )结合，一个亲和素可以结合多个HRP。 生物素与抗体(一抗和二抗)结合后，一个抗体分子可以结合多个生物素分子，抗体活性不影响。 细胞抗原(或通过一抗)首先与生物素化的抗体结合，然后将标记亲和素与抗体的生物素结合，这样就可以多层扩大，提高检测抗原的感受性。

13、 2 .交联亲和素-生物法(BAB法)是将抗原与生化抗体结合后，用游离亲和素连接生化抗体和酶标记生物，达到多层扩增效果。 亲和素-生物素-辣根过氧化物酶复合体法(ABC法)该方法是将亲和素与酶(辣根过氧化物酶)标记生物素以一定比例结合，形成亲和素-生物素-辣根过氧化物酶复合体(ABC复合) 形成这前两种方法的改进，即ABC中未饱和的亲和素结合位点与抗体上的生物结合，最终可以形成格子状结构的复合物，其中大量酶分子联网，基质显色，可以大幅提高检测抗原的灵敏度。 二、SPA法、SPA具有与人和许多动物如豚鼠、猪、小鼠、猴子等IgG Fc结合的能力，该结合不影响抗体的活性。 各SPA分子可同时结合2个

14、IgG分子，一方面可与IgG结合，另一方面可与荧光素酶、过氧化物酶、胶体金、铁蛋白等标记物结合。 三、链霉亲和素技术、链霉亲和素与生物素的结合是自然界最强的非共价键相互作用之一，其功能近似亲和素。 利用生物素键的双抗和酶标记的链霉亲合素构成酶标记链霉亲合素-生物素法(LSAB )。 LSAB法的特征是：特异性强，分子量小，渗透力强，扩增效果远远超过ABC法，因此其敏感性更强的等电点中性适用于组织，可以明显减少非特异性染色，低背景着色可以缩短使特异性着色更加明显的操作时间，变得更加简单。 四、凝集素法，一种凝集素具有特异性结合特异性糖基的能力，同时所有生物膜都含有一定量的糖类，后者主要以糖蛋白和

15、糖脂的形式存在。 因此，凝集素可以作为探针研究细胞膜上的特定糖基。 凝集素具有多价结合能力，与荧光素、生物素、酶、胶体金、铁蛋白等示踪结合，在光学镜和电子显微镜水平显示其结合部位。 细胞膜上的特定糖基可区分细胞的种类，可用于反映细胞在分化、成熟和细胞病变中的变化。 标记对应示踪剂的凝集素，作为细胞分化和成熟的标志物，作为细胞特殊型的标志物肿瘤细胞，伴随细胞膜的变化，细胞膜上的糖基也产生相应的变化，可以用凝集素检测肿瘤细胞。 直接法将标记物直接标记在凝集素上，使切片中对应的糖蛋白或糖脂结合的间接法，是使凝集素直接与切片中对应的糖基结合，使标记物与抗凝集素抗体结合的糖凝集素法本法，是利用过剩的凝集素与组织切片中的特定糖基结合，清洗后，在凝集素中存在尚未被占有的结合部位的第五节其他免疫组织化学检查技术胶体金是指金的水溶胶，能快速稳定地吸附蛋白质，对蛋白质的生物学活性无显着影响。 因此，可以使用能够与金胶体标记一抗、二抗或其他免疫球蛋白特异性结合的分子(如SPA )等作为探针，对组织或细胞内的抗原进行定性、定位或定量研究。(1)免疫金(银)光镜染色技术的基本原理是，通过免疫反应沉积在抗原位置的金胶体粒子发挥