基因工程基本操作过程(目的基因与运载体结合).ppt

1、1、目标基因与载体的结合，是基因工程的基本操作过程，1、2、基因工程，又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为基础，利用分子生物学和微生物学的现代方法为手段，从不同来源的基因按照预先设计的蓝图在体外构建杂交的DNA分子，然后将它们导入活细胞，改变生物体原有的遗传特征，获得新的品种并生产出来。基因工程技术为研究基因的结构和功能提供了强有力的手段。基因工程要素：包括外源DNA、载体分子、工具酶和受体细胞等。a，3，1。目标基因的提取。目标基因与载体的结合(基因表达载体的构建)是基因工程的核心。3.将靶基因导入受体细胞4。目的基因的检测和表达重组DNA技术的切割、嫁接、转化、扩增、检测、操

2、作步骤：a、4、a、5。外源DNA片段与载体分子连接的方法，即体外DNA分子重组技术，主要依靠限制性内切酶和DNA连接酶的作用。基因重组3360使用限制性内切酶和其他酶。切割和修饰载体DNA和靶基因以连接它们，将靶基因插入到自我复制载体中，然后将其转移到受体细胞中，以便外源靶基因可以在受体细胞中被扩增或正确表达。a，6，根据不同的研究目的，精心设计了最终构建的重组分子。需要考虑以下两个方面。如果研究目的是：(1)为了表达有价值的蛋白质，选择合适的调控序列和终止序列如启动子和增强子，将目标基因置于启动子转录起点的下游，并检查阅读框是否正确是非常重要的。(2)为了分析某一基因上游序列的调节功能，有

3、必要考虑选择合适的报告基因，并将可能具有调节功能的靶基因置于报告基因上游的合适位置。如果调节基因可以起到增强子的作用，那么应该在报告基因下游的适当位置插入一个功能基因，从而反映增强子的作用。1.结扎前准备，a，7，a，8。为了将目标基因重组到载体分子中，需要适当处理载体DNA和目标基因，以便它们可以相互连接形成新的重组分子。2.结扎前治疗，a，9。载体DNA通常有许多限制性位点，但不是所有的限制性位点都可以用于重组切割。理想的限制性位点应满足以下条件：载体上的特异性限制性位点应尽可能少，优选单个限制性位点，以确保目标基因和载体DNA以最高概率正确结合。2)在限制性位点之前应该有一个强启动子，因

4、此3)在基因转录和连接后翻译的过程中，所选择的载体不得改变编码区的阅读框架。1。向量的要求，a，10。当用相同的限制性酶切割载体和外源DNA时，形成的DNA末端可以相互匹配，并且可以通过T4连接酶共价连接以形成重组分子。然而，当目标片段的末端与载体不匹配时，有必要转换一个或两个片段的末端形式以连接它们。这种末端转化通常通过以下三种方式进行：3凹端展平：用大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段部分展平3凹端，不匹配的3凹端转化为粘性端；或者完全变平以产生一个末端钝的DNA分子，该分子可以与任何其他末端钝的DNA连接。3-末端切除：T4噬菌体DNA聚合酶具有很强的3-5核酸外切酶活性，可以切除3-

5、末端。平端加合成接头：合成接头是两种化学合成的寡核苷酸的等摩尔混合物，两种寡核苷酸相互互补，并且两种寡核苷酸可以形成具有一个或多个限制性酶位点的平端双链体。因此，通过在钝端DNA上添加接头，可以在亚克隆操作中添加一个或多个限制性内切酶位点。2.结扎前处理：末端转换，a，11。载体脱氧核糖核酸和目标基因脱氧核糖核酸之间的联系。根据DNA片段的不同末端性质，有以下不同的连接方法：粘端连接、平端连接、均聚物加尾连接、人工接头连接，以及用载体连接三个基因的四种方法。a 12 1。与相同限制性位点的连接3360由相同限制性内切酶切割的不同的DNA片段是完整的只要从酶切割突出的单链的粘性末端和酶切割位点附

6、近的DNA序列不影响连接，重组的DNA分子可以在连接酶的作用下形成。上述方法的缺点是限制性内切酶产生的带有粘性末端的载体DNA分子在连接反应中经常发生自环化，并在连接酶的作用下再次成为稳定的共价闭环结构。溶液：线性载体DNA分子用细菌碱性磷酸酶预处理以除去其5-末端的磷酸基团。(1)粘性末端DNA片段的连接，a，13，a，14，2。不同的限制性位点连接由两种不同限制性内切酶切割的：个DNA片段，这两种酶具有相同类型的粘性末端，称为互补末端。外源DNA和载体DNA被两种限制性内切酶切割后，一边产生粘性末端，另一边产生扁平末端(你可以先制造粘性末端，然后再制造扁平末端)。a，15，a，16，双向消

7、化片段定向克隆的优点，外源DNA只能在一个方向插入重组质粒，从而便于靶基因的正确转录和表达。载体与外源性DNA结合处的限制性内切酶位点保留，在被相应的限制性内切酶切割后，可随时从重组载体中分离出目的基因。不会自行循环，转化率高。大多数转化的细菌克隆携带带有目标基因的重组质粒。一些核酸内切酶如Hae和Hpa切割的DNA片段没有粘性末端，但有扁平末端。末端扁平的限制载体只能与末端扁平的目标基因连接。T4DNA连接酶可以催化由相同或不同限制性酶切割的钝端之间的连接。平端连接比粘端连接困难得多，并且其连接效率非常低，约为粘端连接的1%。适用于限制性内切酶切割产生的钝端，适用于填充或切割粘性端形成的钝端

8、。(2)钝端连接，a，18，a，19，提高钝端连接效率的方法包括：增加连接酶的量(比粘端连接多10倍)，增加钝端底物的浓度，增加分子间碰撞的机会；加入10%聚乙二醇8000，促进大分子之间的有效相互作用；加入一价阳离子(氯化钠)。a，20，当不可能在载体两端的限制性位点和外源性DNA片段之间找到合适的匹配时，解决方法是人工接头连接：通过依次添加和连接来合成DNA接头，然后使用限制性酶消化来解决该问题。同源尾连接法：可以通过使用末端转移酶在载体的限制性位点和外源性DNA片段的3个末端添加互补的同源尾来解决。聚合酶链反应方法：利用聚合酶链反应技术扩增外源基因片段，从而添加一个合适限制性酶的单一识别

9、序列，然后用限制性酶消化来解决这个问题。a，21，同聚体加尾连接：用末端转移酶将一段寡核苷酸加到载体和外源双链DNA的3个末端，制成人工粘性末端，不同的寡核苷酸应分别加到外源DNA和载体DNA分子上。在脱氧核糖核酸连接酶的作用下，连接成重组脱氧核糖核酸。这种方法可以应用于任何来源的DNA片段。然而，该方法很复杂，需要核酸外切酶、S1核酶和末端转移酶的协同作用。(3)均聚物拖尾法，A，22，A，23，均聚物拖尾法实际上是一种人工粘端连接法。优点：通过DNA拖尾，不仅可以连接两个平端的DNA片段，而且平端的DNA片段也可以与粘端的DNA片段连接。缺点：它只对质粒载体有效；很难控制质粒和cDNA上的

10、均聚物的长度，a，24，人工接头(DNA寡核苷酸连接)是一种合成的短双链DNA序列，具有一个或几个特定的限制性内切酶识别和切割序列。在平端加入新的酶切位点，然后用限制性内切酶切掉粘端，进行粘端连接。(4)人工接头连接法，a，25，a，26，优点：是一种有效实用的DNA重组方法，具有均聚物拖尾法和粘端连接法的优点，可根据不同的实验要求设计不同限制性酶位点的人工接头。如果在体外连接反应中增加人工接头的浓度，平端DNA片段之间的连接效率将大大提高。缺点：如果待克隆的DNA片段或基因也含有与人工接头相同的限制性酶位点，在消化人工接头的同时，会将克隆的外源基因切割成不同的片段，产生粘性末端，从而给后续操

11、作带来麻烦。自从杰克逊等人于1973年在分子生物学学会上首次提出基因可以被人工重组并在细菌中复制以来，27岁。此后，基因工程作为一个新的研究领域迅速发展，基础研究和应用研究都取得了可喜的成果。这是生命科学发展的一次飞跃，进入了生物性状定向快速转化的新时代，受到了国内外的广泛关注。在过去的几十年中，已经进行了基因工程研究，并且已经建立了多种载体受体系统，它们分别适用于微生物、动物和植物的转基因。已经克隆了许多有用的靶基因，开发了几十种昂贵的基因工程药物，培育了许多具有特殊特征的转基因动物和植物。基因工程成就：20世纪基因工程取得了巨大的进步。至少有两个强有力的证据。一个是转基因动植物，另一个是克隆技术。转基因动物和植物被植入新的基因，这使得动物和植物有了它们以前没有的全新特征，从而引发了一场农业革命。如今，转基因技术已被广泛应用，如抗虫番茄和快速生长的鲫鱼。1997年，世界十大科技突破之一是克隆羊的诞生。这只名叫多莉的母羊是第一只通过无性繁殖产生的哺乳动物，它完全继承了母羊的遗传基因，正是这些基因赋予了它细胞核。“克隆”一度成为人们关注的焦点。尽管存在伦理和社会问题，生物技术的巨大进步给了人类更广阔的想象未来的空间。a，29，a，30，现在，一个国际合作的基因组测序项目已经完成。随着功能基因的不断发展，分离和转基因