分子生物学实验理论与操作教程

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分孑建场学实转理轮身操6米G

中国农科就研究或就

中国金牝义今&幺物学学会

我的痣虫害2物学（8家/我宴徐室

二零零四年七月

目录

口

部6核酸提取

金一：基因组DNA提取

金二：总RNA提取

二部分亚克隆技术

佥三：质粒DNA提取

佥四：DNA片段的酶切

佥五：DNA片段的酶修饰-脱磷一一

金六：DNA片段的连接

佥七：DNA片段的回收

三部分PCR技术

金八：PCR产物的克隆技术

A.1：T-载体构建

A.2：PCR产物的T-载体克隆一

A.3:PCR产物的平端克隆技术

佥九：RT-PCR技术

金十：定量PCR

文库构建技术

:mRNA的提取及纯化

:cDNA文库构建技术-cDNA链的反转合成

：l,cDNA文库构建技术-cDNA链的连接、包装及转染

:2,RACE技术

核酸杂交技术

DNA探针的标记

Southern杂交技术

基因及基因产物检测技术

DNA的测序技术

基因表达1,基因的体外快速翻译

2,基因的诱导表达——

报告基因的应用

Western杂交技术

基因表达轮廓技术

DD-PCR技术

SSH技术

遗传转化技术

感受态细胞制备

重组基因的转化及筛选

原生质体芬篱

农杆菌转化技术

分子标记技术

RFLP技术

RAPD技术

AFLP技术

SSR技术

细胞技术

细胞凋亡

:附录

第——部分核酸提取

目的基因主要可以通过以下途径加以分离获取。对于序列已知或部分已知

的寡聚核甘酸基因片断或基因可通过DNA的人工合成直接获取；或利用PCR、

RT-PCR及RACE技术，直接扩增出相应的基因片段；对于未知序列的基因或

基因片断利用dd-PCR等差异显示技术、转坐子标签技术、分子标记技术、图

位克隆及电子杂交等手段分离出相应目的基因或探针片段，建立基因组文库或

CDNA文库，再用探针从相应文库中钓相关基因。本部分主要介绍基因组DNA

的提取纯化，RNA提取纯化等实验方法，其余内容见相应章节。

实整——：■国组DNA的提取

DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主

要对象，因此DNA的提取也应是分子生物学实验技术中的最重要、最基本的操

作，如不能有效的完成DNA提取方面的工作，那就根本谈不上进行分子生物学

方面的实验。在DNA提取过程中应做到1,根据不同研究需要，保证结构的相

应完整性；2,尽量排除其它大分子成分的污染（蛋白质、多糖及RNA等）；3,保

证提取样品中不含对酶有抑制作用的有机溶剂及高浓度的金属离子。下面结合

不同的研究对象列出几种相应的DNA提取方法.

方3去1,至因组，途DNA的大量提取

本方法通过液氮研磨粉碎动植物组织、裂解液裂解细胞、有机溶剂抽提，

使进入水相的核酸与蛋白成分分开，在RNA酶作用下，降解RNA,得纯度较高

的DNA样品。

——:仪器高速冷冻离心机、台式离心机、恒温水浴、低温冰箱或冰

柜、冷冻真空干燥器、取液器、电泳仪、水平电泳槽、紫外观测仪

二二试齐U细胞裂解液（lOOmMTris-HCl5mMEDTA

500mMNaCl1%SDSpH7.5）;饱和酚；氯仿/异戊醇；异丙醇；70%及无水

乙醇；3MNaAC（pH5.2）;RNA酶；TAE缓冲液;载样缓冲液

三•：操作动植物材料10g（鲜组织）0.5g（干冻组织）

液氮,研碎

10ml裂解液（含1/10体积酚），（65℃预热），

加入等体积氯仿，65℃放置30分钟，

间隔5-10min轻摇一次,

“离心（12000-15000rpm,15min）

上.液

静止下

0.6体积冷异丙醇，

$0.1体积3MpH5,2乙酸钠，

挑取絮状体，70%冷乙醇洗涤，真空干燥，

2mlTE（或水）+lOulRNase,65℃,10-30分复溶和除RNA

,，等体积酚/氯仿，氯仿抽提

2

（轻轻混匀、冰浴沉淀5min,5000RPM离心5min,取上清）

上清液

2V无水乙醇、1/lOVnaAC,

-20,2或-80℃,30min

10000RPM,lOmin

沉“淀

70%冷乙醇洗涤

真空干燥

v

干粉-20C保存，

或复溶于0.5-lmlTE或水中，分装成小体积，-20C或4C保存

四:鉴定

所提DNA进行Agarose胶分析（电泳过程见附），紫外观测仪观测，凝胶

成像系统拍摄。

注意:：

1,裂解液要预热，以抑制DNase,加速蛋白变性，促进DNA溶解

2,酚一定要碱平衡

3,各操作步骤要轻柔,尽量减少DNA的人为降解

4,取各上清时,不应贪多，以防非核酸类成分干扰.

5,异丙醇，乙醇.NaAC,KAC等要预冷，以减少DNA的降解，促进DNA与蛋

白等的分相及DNA沉淀。

6,本方法适用于以DNA片段的酶切分析、Southern印迹等中，具有快

速、省时、省线的特点。

7,此方法也适合菌类基因组DNA的大量提取.

方3去二：/田苗至四组DNA白勺微量提取1去

本方法通过SDS裂解细胞，蛋白酶降解蛋白，CTAB去除多糖成分

——:仅器：同方法一

二二二试齐U二TE、TAE缓冲液；10%SDS;5MNaCL;

20mg/ml蛋白酶K;CTAB/NaCL溶液（10%CTAB,0.7MNaCL4.IgNaCL溶

于80ml水中，缓慢加入lOgCTAB,加热溶解）；25/24/1,酚/氯仿/异戊醇；

24/1,氯仿/异戊醇；异丙醇；70%及100%乙醇

三:操作

1.5ml对数生长期细菌细胞

J离心，5000rpm,Imin

溶于500nlTE缓冲液中混匀

30M110%SDS,3.L蛋白酶K,混匀,37℃,1小时

3

100M1NaCL(5M)混匀

801n的CTAB/NaCL,*混匀；65℃lOmin(可不做)

加入等体积酚/氯仿/异戊醇混合液，混匀，

离心12000rpm,4-5min

取上清，以下操作与方法一中有机溶剂抽提、沉淀、干燥、除

RNA、复溶等步骤一致。

注意1,*此步操作后，离心管中NaCL的浓度不应低于0.5M,否则

DNA将与CTAB共沉淀。

2,本法适用于从多糖含量高的样品中提取DNAO对于菌体样品，通过此流

程，可以获得较为完整的DNA分子。

方注三：酉孝母菌茎固组DNA白勺提取

:彳义君昌:同方法一

—:试齐U：SE缓冲液(1M山梨醇，0.1MEDTApH7.5);溶菌酶

(50mg/ml);20%PVP;蛋白酶K缓冲液(10mMTrispH7.60.5%SDSlmM

EDTA);其余同前

1.5ml对数生长期细菌细胞

“离心，12000rpm,l-2min

溶于590ulSE缓冲液中混匀+10ul溶菌酶37℃,lhr

v离心，12000rpm,8-10min

、I'P-T

讥队

溶于lOOiaL,0.5.1蛋白酶K,混匀，37℃,lhr

加入1.2ml的CTAB/NaCL,200p120%PVP混匀65℃,30min

等体积酚/氯仿/异戊醇混合液,混匀，

v离心，12000rpm,4-5min

上清，以下操作与方法一中有机溶剂抽提、沉淀、干燥、除RNA、

复溶等步骤一致。

实验，总'RNA白勺书是11

完整RNA的提取和纯化，是进行RNA方面的研究工作，如Nothern杂交、

mRNA分离、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及体外翻译等的前提。所有RNA

的提取过程中都有五个关键点，即1):样品细胞或组织的有效破碎；2),

有效地使核蛋白复合体变性；3),对内源RNA酶的有效抑制；4)有效地

将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；5),对于多糖含量高的样品还牵涉

到多糖杂质的有效除去。但其中最关键的是抑制RNA酶活性。RNA的提取目

前阶段主要可采用两种途径，1),提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来；

4

2),直接在酸性条件下抽提，酸性下DNA与蛋白质进入有机相而RNA留在水

相。第一种提取方法将导致小分子量RNA的丢失，目前该方法的使用频率已很

低。

方法——：总、RNA白勺试齐U盒，版速提取

一些公司推出的总RNA提取试剂盒，可以用来制备高质量的可用于建库的

RNA.该总RNA纯化系统采用两种著名的RNA酶抑制剂，异硫氟酸弧(GTC)和

疏基乙醇,加上整个操作都在冰浴下进行,这样就能显著降低RNA的降解速率。

GTC和N-十二烷基肌氨酸钠的联合使用，将促使核蛋白复合体的解离，使RNA与

蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。而进一步从复合体中纯化RNA,则根据

Chomczynski和Sacchi的一步快速抽提法进行,采用酸性酚一氯仿混合液抽

提。低pH值的酚将使RNA进入水相，这样使其与仍留在有机相中的蛋白质和

DNA分离。水相中的RNA可用异丙醇沉淀浓缩。进一步将上述RNA沉淀复溶于

GTC溶液中，接着用异丙醇进行二次沉淀，随后用乙醇洗涤沉淀，即可去除所

有残留的蛋白质和无机盐，而RNA中如含无机盐，则有可能对以后操作中的一

些酶促反应产生抑制。

恒温水浴,冷冻高速离心机,紫外分光光度计,取液器，电泳仪，电泳槽

—:试剂

RNA提取试剂盒,0.05%焦碳酸二乙酯(DEPC),75%乙醇

操作步骤

(一)：细胞或组织破碎

A:彳酸生物材料

1:发酵3-4天(或对数生长期)的菌体，离心收集菌丝体(动植物材料无

需此步处理)

2:用经DEPC处理的水洗菌丝体2-3次，并尽量除去残存的水

3:加液氮充分研磨，使其成为粉末，以释放RNA

4:研磨后的样品转移至12ml变性液的容器中匀浆。

B:动植物Z田月包士音芥本才科(适用的样品量为细胞：108)

1：细胞或组织培养:按常规方法进行

2:深层悬浮培养细胞的破碎：

(1)细胞收集:含一定浓度的细胞培养液置于无菌离心管中，4℃,3000g离心

5分钟

(2)细胞洗涤:上步沉淀用25毫升灭菌后冰冻的1xPBS缓冲液洗涤,然后4

℃,3000g离心5分钟，

(3)细胞破碎:在沉淀细胞中加入15毫升预冷的变性液，用无菌处理过的匀

浆器匀浆

3:表面培养细胞的破碎：

(1)确定培养瓶数量，使选定的各培养瓶细胞累加后总量达10*

(2)细胞收集:将培养液倒掉,用预冷的无菌PBS缓冲液洗涤一次,在培养瓶

5

中加入8毫升预冷变性液,转动培养瓶,使细胞溶解,此时可见粘度加大.

（3）用无菌吸管将第一个培养瓶中的液体吸入第二个培养瓶，旋转，溶解细胞,

再吸入第三个培养瓶，以此类推,直到将所选定的培养瓶全部洗涤一次,然后从

第一个培养瓶开始再加入4毫升上述变性液,将所有培养瓶洗一次.

（4）将上述12毫升含细胞的变性液转移至一50毫升无菌离心管中，匀浆破碎

细胞.

C:植物组织破不卒（适用的样品量为0.05g组织）

⑴将600ul变性液置于1.5ml离心管中，将此离心管放于冰浴中5分钟.

（2）将0.05g新鲜组织用液氮冰冻

（3）在液氮下，研磨组织块

（4）待液氮挥发后，将上述分散的组织转移至无菌离心管中.

D:动物组多只破不卒（适用的样品量为1克组织）

⑴将12毫升变性液置于50毫升离心管中，将此离心管放于冰浴中5分钟.

（2）在上述管中加入1克新鲜或冰冻动物组织，匀浆粉碎.

注1：研磨组织块用于RNA提取的样品，必须是新鲜的细胞或组织，如采样后，不

能立即用于提取则样品应用液氮速冻并贮于-70C的冰箱中保存。

2:变性液及相应的离心管需预冷

）：RNA白勺寺由提

在经变性液匀浆的细胞或组织600ul+60ulpH4.0的2M乙酸钠彻底混

”匀，可用漩涡振荡器

600ul酚'氯仿'异戊醇（25\24\1）,彻底混匀或漩涡振荡器振荡10秒

”冰裕中10-15分钟，

离心，4C,10000g,20分钟

上层水相吸至无菌离心管中+等体积的异丙醇,-70℃,30分钟沉淀RNA

立离心4℃,10000g,20分钟

沉淀RNA,冷冻干燥15分钟，RNA沉淀重新溶于300ul变性液中，可

振荡（有时为了帮助溶解，可在65C加热，但时间应极短）

60ulpH4.0的2M乙酸钠彻底混匀，可用漩涡振荡器

I600ul酚'氯仿'异戊醇（25\24\1）,彻底混匀或漩涡振荡器振荡10秒

|冰裕中10-15分钟，

离心，4℃,10000g,20分钟

上层水相吸至无菌离心管中

’等体积异丙醇二次沉淀（-70℃,30分钟），75%乙醇洗沉淀,沉淀冷

冻干燥，复溶于去RNA酶的水中（对于准备长期保存的RNA可加入pH5.0的乙

酸钠至终浓度为0.25M,再加入2.5体积的乙醇，-70c保存。）

注：1变性液组成：25g异硫氟酸胭溶于33mlCSB（42mMpH4.0乙酸钠、0.83%

十二烷基肌氨酸钠、0.2mM。-疏基乙醇），65C溶解，过滤灭菌，4℃预冷。

2酸性酚配制：55℃时，500g酚溶入500ml50mM,pH4.0乙酸钠，混匀，静止分

6

层后,去上清,再反复加500ml50mM,pH4.0乙酸钠，直到pH<4.1。

方法二：氤彳七锂3去提取，途RNA

本方法用高浓度尿素变性蛋白并抑制RNA酶，用氯化锂选择沉淀RNA,

其特别适合于从大量样品中提取少量组织RNA,具有快速简洁的长处，但也存

在少量DNA的污染及RNA得率不高，小RNA片断丢失的缺陷。

仪器：同上

试剂二

氯化锂/尿素溶液【氯化锂126g(3M)尿素、360g(6M)加水至1L,过滤灭菌】

悬浮液【10mMTris-HCL(pH7.6),ImMEDTA(pH8,0),0.5%SDS]

其余同上

操作步深二

1：对于大量组织或细胞，则每克组织或细胞加入5-10ml氯化锂-尿素溶

液，匀桨器高速匀桨2分钟；对于少量细胞(107个细胞/ml),则每克组织

或细胞加入0.5ml氯化锂-尿素溶液手工匀桨，并转移至Eppendof管中

2：匀桨液在0-4℃放置4小时后，12000g离心30分钟

3:取沉淀，加入原匀桨液1/2体积的氯化锂-尿素溶液，重复步骤2

4：沉淀用原匀桨液1/2体积的氯化锂-尿素溶液复溶后，加入等体积酚/

氯仿/异戊醇在室温放置15-30分钟并不时摇动混匀，4000g离心5分钟

5：取上层水相，加1/10倍体积的3M乙酸钠(pH5.2)及2倍体积的乙

醇,-20℃放置1小时，5000g离心。

6：70%乙醇洗沉淀一次。真空干燥。

7：RNA溶解液溶解沉淀，得RNA,分装，于-70℃保存。

力~3去三_:白一拼V3去

本方法适合于病毒RNA的提取

仪器二同上

试齐蛋白酶K(终浓度50ug/ml)

2x缓冲液：1%SDS20mMTris-HCL(pH7.6)0.2MnaCL

其余同上

操作:

1,提纯病毒液中加入等体积缓冲液、蛋白酶K,37C40-50分钟

2,加入等体积65C预热的酚溶液，轻徭，在65C保温5分钟后再轻徭。

3,离心，取上清，氯仿抽提一次

4,取上层水相，加1/10倍体积的3M乙酸钠(pH5.2)及2倍体积的乙醇，-

20℃放置1小时，5000g离心(10000g,lOmin).

5,70%乙醇洗沉淀一次。真空干燥。

6,RNA溶解液溶解沉淀，得RNA,分装，于-70c保存。

上面介绍了一些核酸(DNA、RNA)提取方法，在进行具体实验时，应根据

研究对象的性质，提取核酸的用途而对上述方法在操作步骤和试剂使用量上作

7

一定的修改。以下一些原则和建议对核酸提取的操作可能会有一定的裨益。

1:在核酸提取时，为了增加细胞的裂解度，增加核蛋白复合体破碎度，以释

放更多的游离核酸，在操作中常要用到溶菌酶和蛋白酶K,在确保没有核酸水

解酶存在的前提下，酶反应时间越长越好。

2：有时在使用蛋白酶时，为了抑制核酸水解酶的降解作用，可在蛋白酶缓冲

液中用终浓度5mM的EDTA代替NaCL,并且可将反应温度提高到50-60℃,并

将反应时间缩短到15-25min,但酶用量必须提高10-20倍。溶菌酶使用时

缓冲液中需加EDTA,因游离金属离子对酶有抑制。

3:许多植物材料中富含酚，在细胞破碎时，在多酚氧化酶作用下，被氧化成

有色的银类物资，影响核酸的提取及降低提取质量，在提取液中加入PVP和疏

基乙醇对降低酚类的干挠可能有所帮助。PVP将与酚形成复杂的聚合体，在提

取时将酚从核酸成分中游离。且PVP与疏基乙醇作为强还原剂可防止多酚的褐

变。另外作为还原剂的这些成分在一定程度上可抑制核酸水解酶的作用。

4：许多生物材料在提取核酸时，都会遇到多糖的污染问题，具体表现为有机

溶剂沉淀时，沉淀很多，但复溶时，大量沉淀不溶，电泳观察时核酸含量很

低。克服多糖污染可采用以下一些办法

(1)CTAB多次抽提。

(2)在有机溶剂沉淀时先稀释样品浓度(可到10倍左右)，对低浓度

样品再进行沉淀。

(3)在有机溶剂沉淀时选用异丙醇和5MNaCL作为沉淀溶剂，此时氯化

钠的用量可用到1/5-1/2的体积，异丙醇可用到0.6-1的体积。异丙醇沉

淀核酸时，高浓度盐存在将使大量多糖存在在溶液中，从而可达到去多糖

的作用。但高浓度的盐存在会影响核酸的进一步操作，因此必须用乙醇多

工人洗^洛•盐^

5:在核酸提取质，酚与氯仿均起到变性的作用。酚的变性能力强于氯仿，但

酚与水有一定的互溶，因此酚抽后，除可能损失部分核酸外，水相中还会残留

酚，而酚的存在将对核酸的酶反应产生强的抑制，因此在操作中可单用氯仿作

变性剂、也可用酚/氯仿混合变性，也可用单一酚作变性己，但用单一酚后在

有机溶剂沉淀时一定要用氯仿从抽提。

6：在操作中当加入变性剂氯仿后，为了保证核酸样品的完整性，操作要轻，

尤其在提DNA时，更要避免剧烈操作。

7：在沉淀核酸时可用乙醇与异丙醇，乙醇的极性要强于异丙醇，所以一般用

2V乙醇沉淀，但在多糖、蛋白含量高时，用异丙醇沉淀可部分克服这种污

染，尤其用异丙醇在室温下沉淀对摆脱多糖、杂蛋白污染更为有效。

8:在提取核酸时，如样品浓度低，则应增加有机溶剂沉淀时间，-70C下

>30min;-20℃过夜将有助于增加核酸的沉淀量。

9：在核酸提取过程中有机溶剂沉淀后复溶时可加水因此时离子浓度可能较

高，而到高度纯化后低温保存时最好复溶于TE缓冲液中，因溶于TE的核酸储

8

藏稳定性要高于水溶液中的核酸。另外核酸样品保存时要求以高浓度保存，低

浓度的核酸样品要比高浓度的更易降解。

10:核酸提取后可通过PCR、RT-PCR直接扩增出目的基因片断，也可首先构

建文库、然后由RACE、dd-PCR等差异显示技术、AFLP等标记技术、差异杂交

或文库扣除技术等方法筛选出特异探针，再用此探针从文库中筛选出完整基

因。有关这些内容在下面各篇幅中会详细介绍。

第二匐3分：至因克隆技术

目的基因的克隆是分子生物学实验中的核心内容，起着承上启下的作用，

通过克隆技术可实现目的基因的无限扩繁、长期保存的目的；利用该技术能实

现基因重组、基因改造、构建工程菌和转基因动植物。基因克隆技术主要包括

载体的获取、酶切、脱磷、连接和转化及筛选、鉴定等内容。本部分将介绍除

基因鉴定外的其他内容。

实马佥三:质粒DNA白勺提取不口名屯彳匕

整合外源DNA并将其带入宿主细胞的过程是分子克隆的关键。而在此过程

中携带外源基因的工具为载体。载体有1）在宿主细胞中具独立复制能力；2）

带抗性等选择标记；3）有合适的限制性内切酶位点，可插入一定片断长度的外

源DNA而不影响自身复制的特点。目前经基因操作已构建了一大批适合不同宿

主细胞，有不同选择标记的克窿载体或表达载体。这些载体有以下几类：1）宿

主为大肠杆菌的细菌质粒、Lamda噬菌体、噬菌粒、噬菌体M13、拈粒和卡粒

等；2）宿主菌为酵母的以酵母人工染色体克隆系统（YAC）为代表的酵母菌质

粒载体及酵母菌与大肠杆菌穿梭质粒载体；3）以枯草杆菌为载体的枯草杆菌质

粒载体和芽雹杆菌与大肠杆菌的穿梭质粒载体；4）宿主为植物细胞的Ti质

粒、植物病毒及带有真核启动子的改造质粒；5）动物细胞为宿主的动物病毒和

以动物病毒为基础改造的穿梭质粒。在上述所有载体中通用型大肠杆菌质粒载

体因具有通用引物序列、多克隆位点区具极多的内切酶特异序列、许多具。互

补性质等特点而成为最基本的通用克隆载体。

在克隆操作中往往都是将待克窿片断先克隆到通用大肠杆菌载体的多克隆

位点区，或直接测序或根据需要再克隆到其他载体上。大肠杆菌质粒多为一些

双链、环状的DNA分子，其大小范围从lKb-200以上Kb不等，它们是独立于

细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。质粒的存在能赋于菌体一

些特殊的表型，这些表型主要有对抗生素的抗性、修饰酶等。

质粒DNA的提取根据实验目的不同，可以有不同的方法，但基本步骤多为

三步，第一细菌培养和质粒的扩增，第二细菌菌体的裂解，第三质粒DNA的纯

化。菌体裂解方法不同，决定了质粒DNA提取方法的差异，目前菌体裂解方法

主要有煮沸法，SDS法,碱解法,Triton-溶菌酶法等。质粒DNA的纯化方法主

要有梯度离心法、柱层析法等，但由于目前所用质粒的复制量极大，小量常规

9

制备的质粒既可以满足内切酶图的绘制、细菌转化、特定DNA片段的分离、常

规亚克隆及探针标记等方面的工作需要.在质粒DNA提取中，质粒DNA的质量

和产量在很大程度上受培养条件的影响，通过一些实验发现，下列培养方式能获

得较好的结果：

1培养应用菌龄不超过4天的平板单菌落作为起始菌

2培养菌应在37℃,220rpm下，生长16-18小时

3不能用经储藏的培养菌直接进行质粒提取制备。

下面介绍几种质粒DNA提取的方法：

方3去一：碱解3去提取■屋粒DNA

-本方法适合于质粒DNA的微量提取

超净工作台、超级恒温器或恒温水浴、台式离心机、培养箱、取液器、摇床、

冷冻真空干燥器、低温冰箱或冰柜、电泳仪、电泳槽、紫外观测仪

—:试剂

1：SolutionI50niM葡萄糖，

25mMTris-HCl(pH8.0)

lOniMEDTA(pH8.0),高压灭菌，4℃保存

2：Solution110.2MNaOH,1%SDS,现配现用

3：Solution1115MKAC60ml,11.5冰乙酸，28.5水，4℃保存

4：3MNaACpH5.2高压灭菌，4c保存

5:氨节青霉素50mg/ml,

6:溶菌酶

7:酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)

8:异丙醇

9：LB培养基

10:电泳试剂见附

11:TE缓冲液

三：操作步骤

含氨卞(lOOug/ml)的LB培养基培养菌体37℃200rpm过夜

I

吸取1.5ml

J离心，5000rpm,Imin

讥灰

(充分去除LB培养液)

加入预冷的lOOulSolutionI,充分振荡悬浮

加入200ulSolutionII,颠倒徭匀后冰浴中3-5min,

加入150ul预冷SolutionIII混匀，冰浴5min

v离心，12000g,5min

取上清

1o

酚/氯仿/异戊醇、氯仿各一次，离心5000g5min

上清

|0.6体积的异丙醇，室温，5min,离心，12000g,,5min

沉淀冷冻干燥

悬于50pIdd水或TE

RNA酶至20ng/ul37-65℃,30-60分钟(可不做)

酚/氯仿、氯仿抽提、乙醇沉淀(-70℃,15min/-20℃,2hr)

、，离心10000g,5-10min

沉淀►冻干►复溶

-20C保存1电泳鉴定

注1：试剂中所用葡萄糖有增加粘度，降低剪切率，减少DNA的降解

2:试剂中所用EDTA有抑制DNase的作用，还能降低离子浓度，而高浓度离

子对溶菌酶有抑制作用。

3:试剂中所用NaOH能使DNA变性，KAC能使DNA复性,并有助于蛋白等其

它大分子成分沉淀。

4：如A,不用酚/氯仿抽提;B,LB培养基残留；C,提取中在溶液II中时间过

长，导致共价闭合环状DNA不可逆变性，则可能影响酶切。

质粒提取方法还有很多，如要进行重组质粒的植物转化或质粒测序则应进

行氯化钝梯度离心，或直接采用试剂盒提取。

另试剂盒提取可同时进行许多质粒的提取，能在最短时间内获取高质量、

高浓度的质粒DNA

如果要提取大质粒DNA则建议使用溶菌酶裂解细胞，以释放质粒DNA

实脸四:DNA片断的联切技术

限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子中特异核甘酸序列的DNA水解酶,

这类酶的发现和应用促进了以DNA重组为基础的生物工程技术的迅猛发展。该

类酶是体外剪切基因片段的重要工具，基因物理图谱的绘制、核甘酸序列的测

定、基因片段的重组，重组子的筛选、探针的制备及各种杂交、测量基因的拷

贝数,基因文库构建，分子标记等都离不开限制性内切酶的应用。另外以限制性

内切酶为基础的各种限制性内切酶片段长度多态性分析，促进了分子遗传学、

分类学等相关学科的应用和发展。可以这么说，没有限制性内切酶的发现和应

用就没有现代意义上的分子生物学、分子遗传学，也就不会有任何基因工程产

品。而对于从事分子生物学或相关领域研究工作的人员讲来，如果不能很好地

了解和掌握内切酶技术，那就根本不可能开展这方面的任何工作。

本部分实验主要通过EcoRI,HindHI两种限制性内切酶对入DNA的单

酶切、双酶切及部分酶切的操作，使学员能掌握内切酶的实验操作技术

--::

离心机、恒温水浴、取液器、电泳仪、电泳槽、紫外观测仪

—：试剂

11

EcoRI,HindIII,入DNA/HindlH及入DNA/EcoRI标准质粒（或其他DNA样

品）（浓度＞0.5ug/u1）TAE缓冲液

三：操作

（一）EcoRI、HindIII单酶切及双酶切

1,取2支干净、灭菌新Eppendof管，分别按下表加入

A（uDB（|n1）

灭菌水1313

EcoRI缓冲液2

HindHI缓冲液2

入DNA（或质粒DNA）44

EcoRI1

HindIII1

总体积2020

2,37c保温1-4小时

3,保温结束后65-70C10min灭活酶（如为热稳定性酶，则用氯仿抽提）

4,取2口1左右的反应液加入2*1电泳加样缓冲液，电泳

（二）EcoRI、HindIII双酶切

1,取一支干净、灭菌Eppendof管,按下表加入各种试剂

加入试剂体积（口1）

灭菌水12

MULTbuffer2

入DNA（或质粒DNA）4

EcoRI1

HindIII1

总体积20

2,37℃保温1-2小时

3,保温结束后65-70℃10min灭活酶（如为热稳定性酶，则用氯仿抽提）

4,取2*1左右的反应液加入2口1电泳加样缓冲液，电泳

9主意;1,样品加入次序为水、缓冲液、DNA最后为酶，不应颠倒，

2,加酶步骤要在冰浴中进行，在加酶前应先将水、缓冲液及待切DNA

混匀

3,反应体积中水的量要尽量少，即反应体系的体积要尽量少，一般水

解0.2-lug模板DNA时，应将体积控制在20-30U1内。但要保证所加酶的体

积不高于总体积的1/10,因为限制性内切酶是保存于50%甘油中的，如加酶体

积高于总体积的1/10,则反应液中甘油浓度将大于5%,而此浓度将抑制内切

酶活性。

4,为了控制反应体积和促进反应进行，要求模板DNA的浓度应很高，

否则反应体系中DNA浓度太低则将引起酶反应动力学改变、降低酶解效果，此

时不得不增加反应体积；而一般为了增加DNA储藏的稳定性，DNA多保存在TE

12

缓冲液中，如反应体系中过多加入模板DNA溶液则势必造成反应体系中EDTA

浓度升高，而对酶产生抑制。因此如底物DNA浓度过低则应进行浓缩。

5,本实验中双酶切时，因两种酶的缓冲液盐浓度要求相同，所以，可

在同一反应体系中完成双酶切。但如进行双酶切时，两种酶所需缓冲液盐浓度

要求不同，则不能将两种酶同时加入同一体系，进行反应，此时可采取下列处

理办法

a：先用在低离子强度的缓冲液中活性最高的酶切割DNA,然后加入适量的

NaCL及第二种酶，继续保温。

b：使用所有限制酶均可作用的单种缓冲液(谷氨酸钾缓冲液)。

C:一种酶水解完后，进行有机溶剂抽提，沉淀、干燥后再复溶然后进行第

二种酶切。

在上述3种方法中遇到最多的可能为C

6,在水解结束灭活酶时可采用65℃加热10分钟或加EDTA至终浓度

二者各有利弊，加热简单但对有些酶灭活不彻底。EDTA对酶的灭活彻

底，但EDTA存在将使连接反应变得极为困难，因此在连接前要求重新用有机

溶剂抽提，这将增加操作难度和导致DNA的损失。

有关DNA限制性内切酶使用中的一些其他问题可参见附录。

实马佥五:脸切片断的月兑程埠技术

在对DNA片段的修饰中，脱磷酸化反应是一个重要内容，该反应有碱性磷

酸化酶催化，该酶可使线状DNA上去除"磷酸基团，而DNA的脱5,磷酸基团

是基因重组、载体构建中防止载体DNA自身联接、环化的重要途径，载体经单

酶切线性化后，3,端为羟基、5,端为磷酸基，在连接酶作用下将以极大比例发

生载体自连，而5,脱磷后，载体在5,与3,位均为羟基不能自连只有与带5,磷酸

基的外源片断连接，载体与外源片断间形成一个磷酸二脂键和一个缺口，缺口在

转移进细胞后修复.另外脱磷作用还可发生在RNA、DNA、三磷酸腺甘、脱氧三

磷酸腺昔的5,端，这个反应是进行探针标记操作中的重要环节。

——：仪器离心机恒温设备真空干燥机取液器

—：试剂

碱性磷酸酶、入DNA酶切片段、酚、氯仿、0.5MEDTA(pH8.0)、SDS、

TE缓冲液、电泳缓冲液、7.5MNH4AC(pH7.5)

10x碱性磷酸酶缓冲液：lOmMZnCL

1OmMMgCL

lOOmMTris-HCL(pH9.0)

彳小

1:在实验四所得DNA限制性内切酶片段中加入

10x碱性磷酸酶缓冲液10M1

碱性磷酸酶(0.Olu/pmolends)l-2ul

ddH20到lOOul

13

对于5,突出则37℃下温浴30分钟，再加入lulCIAP（O.Olu/pmolends）,37℃

下温浴30分钟.

对于平末端或3,突出末端，则37℃下温浴15分钟，56℃下温浴15分钟，再加

入lulCIAP（0.Olu/pmolends）,37℃下温浴15分钟.56℃下温浴15分钟

2：温浴结束后加入EDTA（pH8.0）至终浓度分别为10mM,65℃加热

20min,以灭活碱性磷酸酶

3：用酚、氯仿各抽提一次

4:加入1/2体积NH4AC,充分混匀，再加入2体积的乙醇，-20℃放置

2hr（或-70C30分钟），12000g离心10分钟，沉淀DNA。

5:冷70%乙醇洗沉淀一次

6:TE溶解（终浓度为100叱/口1）,-20C保存

四:棒测

将脱磷片断中加入连接酶，以加入连接酶的非脱磷片断作为对照，，连接反应

后，Agarose电泳分析，脱磷片断不能连接，而非脱磷对照片断能连.

3主:1,pmolends=3.04xugDNA/DNA的碱基数

2,在上述几个实验中，有机溶剂沉淀时所用NaAC的pH最好为7.2或用7.5M

的NH4AC,如用pH5.2的溶液则有可能导致EDTA沉淀量增加，影响以后的连

接反应。

3,碱性磷酸酶有两类BAP（细菌碱性磷酸酶）和CIP（小牛肠道碱性磷酸

酶），因BAP耐热，灭活时必须采用有机溶剂抽提法，而CIP在68C10%SDS

条件下级可灭活，因此实验中一般都采用CIP。

实马佥六二至四的重组连接技术

DNA酶切片段的连接是分子生物学实验中又一关键技术，该技术是基因重

组，基因改造的重要中间环节。两DNA片段相邻的5,磷酸和3,羟基间可由连

接酶催化形成磷酸二酯键，这个连接反应在体外一般都有大肠杆菌DNA联接酶

和T4DNA联接酶催化，但分子生物学实验中主要采用T4DNA联接嚼，因该酶在

正常条件下，即能完成连接反应。在分子生物学实验中连接酶主要用于1）基

因重组中载体与外源基因的连接；2）接头与DNA片断的连接，这种连接一般

发生在文库构建、分子标记的AFLP及差异表达的研究等中。连接反应可在溶

液中进行也可在琼脂块中进行。本课程中在AFLP、文库构建、PCR片断的克隆

等中均有连接的内容，在本部分仅以重组克隆为目的介绍相应的连接类型。在

基因重组克隆中外源DNA与载体的连接是承上启下的一步操作，根据连接片断

末端类型不同，连接方式有粘端连接、平端连接等和平粘端连接及单碱基配对

的T-载体连接。其中粘端连接的效率最高，粘端连接与平粘连接中外源DNA

片断在载体中的插入有方向性。平端连接的效率最低，且载体发生自连的比例

较高，因此在克隆操作中为了克服平连的弊端，通常可通过l）TdT酶在载体和

外源DNA片断上转移一互补序列（核甘酸投影法）；2）在载体和外源DNA片断

上加上人工接头，变平连为粘连。下面拟通过T4DNA联接酶对酶切片段的连接

14

操作，使学员掌握这一DNA片段的连接操作技术。

A：班液中迂接

——：仪器离心机、恒温设备、真空干燥机、取液器

—：试剂

T4DNA联接酶

10xT4DNA联接酶缓冲液

200mMTris-HCL（pH7.6）、50mMMgCL2>5mMATP、50mMDTT

500ng/ml/牛血清白蛋白（可不用）

入DNA/HindHI酚/氯仿、酚、氯仿、TE缓冲液、电泳缓冲液、3M

NaAC（pH5.2）

彳后：

1：取干净、灭菌Ephondof管，安下表加入各试液

T4DNA联接酶缓冲液lul

载体DNA片断Ing

插入目的片断Xng

连接酶lu（平末端,如为粘端连接，则酶量可小于lu）

加无菌水到10ul

X=目的片断与载体片断的分子比例x载体ng数x目的片断的碱基数/载体ng

数

（目的片断/载体片断的分子比例一般为3/D

2：连接反应

22℃保温3小时或4c过夜（Promega连接酶，粘端连接）

或22-26℃lhr（BRL连接酶，粘端连接）

或22℃4-16hr（Promega连接酶，平端连接）

或14C16-24hr（BRL连接酶）

B：月交内连接：该方法是一种快速克隆技术，将要重组连接的外

源DNA片断用低熔点琼脂糖分离，在紫外灯下切下待克隆片断，溶化后加入缓

冲液、载体DNA、连接酶直接连接。这种连接的待克隆片断既可以为酶切基因

组片断也可为PCR片断，既可平连也可粘连，但连接效率较溶液中连接要低的

多，但这种连接省去了待克隆片断的回收纯化操作。这种连接方法要求目的

DNA量、载体量及酶量都要增加。

——：仪瞿：同A

—：试齐U：同A

1：低熔点琼脂糖胶分离外源DNA片断，在紫外灯下切下目的片断

2：65c保温彻底溶化琼脂，取18ul（约0.1-0.5ug）于一新管内再加入2ul

载体（约0.01-0.05ug）混匀，37℃5-10min

3:配制2xT4DNA连接酶反应体系20ul,（其中含2xT4DNA连接酶缓冲液和

不低于2uT4DNA连接酶）混匀，点动离心后置于冰浴

15

4：将预冷的2xT4DNA联接酶反应体系20ul加到“2”中含待连接DNA样品管中

立即混匀后立即置于冰浴中待凝固

5：置于12C连接过夜。

6:此连接片断可直接用于转化，即转化前65C溶化，取5-lOul转化。

注1：粘端连接时模板DNA用量控制在0.1-0.5ug间，而平连时模板量应

>0.5ugo拈连时温度可在4C过夜，而平连时最好在12-16C过夜

2：用于转化的连接片断最好不要冰冻

3:胶内连接时，应用TAE缓冲液，而不应用含TBE的胶，因硼酸能与琼脂糖

中的方式糖单体或多聚体结合成难溶复合物，这种复合物使胶难熔解，将抑制

连接酶

4：在紫外光下观察切割条带时，操作要快，DNA条带在紫外光下的暴露时间应

尽量短，因UV会引起DNA变异。

实验七二DNA片比斤白勺回U攵技术

目的DNA片段的回收技术是重组DNA中的关键技术，回收是指从电泳介质

中纯化出目的片断。目前待回收的片断主要有酶切片断和各种PCR片断；回收

的介质主要有琼脂糖和PAGE;回收的方法主要有树脂回收、微量柱回收、玻

璃奶回收、液氮冻冻融回收及透析袋大量回收等，下面分别介绍树脂、微量柱

及液氮冻冻融回收技术。

方法——：树月旨回收技术

本方法特别适合于PCR片段的回收，具有纯度高、操作简洁等特点，经

此方法回收的片段可有效的用于重组载体构建。通过15分钟的纯化过程,PCR

产物即能被有效地从含引物二聚体、非特异性扩增引物片断等混合物中分离出

来，成为高度无盐的、不含其他大分子成分的纯化片断。在较宽的分子量范围

内有较高的回收效率。下表为不同长度的DNA片断,在室温条件下，用此纯化系

统直接纯化时，各自相应的回收率。

dsDNA长度bp20015003002007550

回收率%>6096996932

一：仪器离心机电泳议电泳槽取液器微量真空装置抽滤装置

二：PCR片断纯化试剂盒80%异丙醇

三：操作

（一）从琼脂糖介质中纯化DNA片断

1：用低熔点或常规熔点琼脂糖电泳对PCR扩增片断进行分离，该电泳安常规方

法进行，缓冲液为TAE.

2：在凝胶上,找到所需条带，然后用洁净并灭菌的小刀将其切下接近300微升琼

脂糖凝胶（约300毫克）

3:如果切下的琼脂糖为高融点的则安下面A步骤进行,如为低融点琼脂,则安B

步骤进行。

A：将300微升琼脂块放进1.5毫升的微量离心管中，加入1毫升纯化用树脂,

16

然后将其置于65℃水浴保温5分钟，或保温至琼脂完全溶解。

B：将300微升琼脂块放进1.5毫升的微量离心管中，然后将其置于70C水

浴保温至琼脂完全溶解,然后加入1毫升纯化用树脂到融化好的琼脂中，将其混

合20秒,但不要振动。

4:为每一个待回收片断准备好一个微量柱.在每个柱的开口处,联上一针筒，然

后将这些柱与针筒的复合体与抽真空设备相连

5:在柱-针筒复合体中加入树脂/DNA混合物，打开真空装置，将树脂与DNA的混

合物抽到微量柱中，断开真空装置与柱的连接。

6：洗柱,加入2毫升80%的异丙醇，打开真空装置,使这些洗柱液完全流经微量

柱。

7：继续真空30秒以干燥树脂,注意此干燥时间不能超过30秒。关闭真空，移去

针筒。将微量柱转移至一1.5毫升微量离心管中。10000g离心2分钟，以彻底

除去残存的异丙醇。

8:将微量柱，再转移至一新的1.5毫升微量离心管中，加入50微升水或TE缓

冲液，静置1分钟（在头30秒,DNA仍将吸附于柱上），10000g离心20秒，以洗

脱DNA片断，所得纯化后的DNA片断可直接用于连接反应或在-20C保存。

注：1对于＞3Kb的片断在纯化回收时，洗脱前，如先将水或TE缓冲液预热到

65-80C,则将能有效的提高回收率。待洗脱片断＞3Kb时，洗脱液温度应为65-

80c待洗脱片断＞20Kb时，洗脱液温度应达80C。

2应用TAE缓冲液，而不应用含TBE的胶，因硼酸能与琼脂糖中的方式糖单体

或多聚体结合成难溶复合物，这种复合物使胶难熔解。

3:在取用纯化柱树脂中的液体前，应将树脂充分搅匀，如树脂中出现结晶或结

块,则应将树脂在25-37C,温热10分钟，冷却至30℃使用。树脂本身不会溶。

4：在紫外光下观察切割条带时，操作要快，DNA条带在紫外光下的暴露时间应

尽量短，因UV会引起DNA变异。

.■

PCR回收示意图

17

(二)尿素丙烯酰胺变性胶中分离DNA片断

1：从变形胶上切下待回收片断，将其放如一微量离心管中。

2:加入100微升TE缓冲液，37c保温30分钟以上。

3:将上清液吸入一新管中，加入1毫升树脂，振荡20秒以混匀树脂与清液

4-8:同(一)中

方法二：微量柱法纯化DNA片段

本方法具有操作简单的特点，特别适合于PCR片段、酶切片段等的回收

一：仪器：同方法一

二：试剂：微量柱、其它试剂同方法一

三：操作：

1：紫外灯下从胶上切下目的片段，放入一Epphendof管中

2：离心管在-20c冷却5-10分钟

3：将微量柱下套上一Epphendof管，将冷却的胶条装进微量柱中，4℃

12000rpm离心10分钟

4：弃微量柱，用酚/氯仿、氯仿抽提Epphendof管中液体各一次

5:1/10体积乙酸钠+2体积无水乙醇沉淀2小时

6：70%乙醇洗沉淀，真空干燥，复溶于dd水或TE中

方法三：液氮冻融法

-：仪器同方法一

-：试剂：液氮，其余同方法一

三：操作：

1：紫外灯下从胶上切下目的片段，放入一Epphendof管中

2：离心lmin,加入500U1TE,200ul酚/氯仿混匀

3:离心管放入液氮中10-15min,再室温放置，反复冻融

4：用酚/氯仿、氯仿抽提Epphendof管中液体各一次

5:1/10体积乙酸钠+2体积无水乙醇沉淀2小时

6：70%乙醇洗沉淀，真空干燥，复溶于dd水或TE中

方法四：从变性PAGE中纯化DNA片断的常规方法

一：仪器：同方法一

二：试剂：PAGE电泳试剂TE无水乙醇70%乙醇

洗脱缓冲液I(10mMTris-HCLpH8.00.IMmEDTApH8.0)

洗蕨缓冲液11(0.5MNH4AClOmMTris-HCLpH8.00.IMmEDTApH8.0)

三：操作：

1：PAGE电泳，如EB染色的则在紫外灯下切下目的片断，如龈染或其他非放

染色的则在关下切下目的片断

2：用少量脱缓冲液I将目的片断胶条洗至一Eppendorf管中，用玻棒将凝胶

捣碎，用150