乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药的检测

乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药的检测一、HBV耐药的有关定义二、各种耐药检测技术的评价三、需要重视的几个问题一、HBV耐药的有关定义

病毒学突破（virologicbreakthrough）病毒反跳（viralrebound）生化学突破（biochemicalbreakthrough）HBV基因型耐药（genotypicresistance）HBV表型耐药（phenotypicresistance）临床耐药（clinicalresistance）NdeI限制酶的识别序列和切割位点：检测技术的可靠性和稳定性HBVDNA>105copies/ml183例CHB患者中，检出存在YMDD突变毒株者共40例，检出率为21.MALDI-TOFMS检测

HBVYMDD变异的原理突变株比例小于20%时，由于竞争抑制作用不能被扩增。CATATG细胞外HBV聚合酶活性分析。碱基变异可能导致：不需酶促反应，可以对寡核苷酸测序。病毒反跳（viralrebound）指核苷类药物治疗过程中患者的血清HBVDNA水平一度被抑制，但在继续治疗中血清HBVDNA升高至＞2×104IU/mL或高于治疗前水平。用化学试剂在A、G、C、T处特定的裂解DNA片段，产生一簇各种长度的短链，经过PAGE放射自显影可直读DNA顺序。该方法类似于细菌药物敏感试验。②产生新的位点HBV耐药的有关定义

病毒学突破（virologicbreakthrough）指在核苷类药物治疗过程中，患者的血清HBVDNA水平一度被抑制，但在继续治疗中血清HBVDNA水平与最低值相比上升或超过1个log10（10倍）。HBV耐药的有关定义

病毒反跳（viralrebound）指核苷类药物治疗过程中患者的血清HBVDNA水平一度被抑制，但在继续治疗中血清HBVDNA升高至＞2×104IU/mL或高于治疗前水平。

HBV耐药的有关定义

生化学突破（biochemicalbreakthrough）指在核苷类药物治疗过程中血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平一度复常，但在继续治疗中血清ALT水平又再次升高。肝脏生活指标很多，但是在此仅指ALT。HBV耐药的有关定义

HBV基因型耐药（genotypicresistance）指HBV基因组中的某些位点发生改变，导致这种药物对HBV的抑制作用下降或消失。这种HBV基因变异与HBV的耐药性有直接因果关系，通过这些变异位点的检测可判断HBV有无耐药性。HBV耐药的有关定义

HBV表型耐药（phenotypicresistance）通过体外细胞培养方法，直接测定HBV对某种药物的敏感性，或者在体外直接测定HBV聚合酶的活性，敏感性的降低或酶活性的下降均表明有耐药，即表型耐药。通常以IC50来评估IC50＜5倍:敏感IC50在5～10倍:部分耐药IC50

＞10倍:耐药HBV耐药的有关定义

临床耐药（clinicalresistance）指临床出现病毒复制不能被抑制，或HBV复制一度被抑制后又出现HBVDNA反跳，同时伴有ALT升高，或肝炎复发的其他临床证据。二、各种耐药检测技术及评价病毒学反跳或突破的监测HBV基因型耐药监测HBV表型耐药检测临床耐药监测病毒学反跳或突破的监测基于对血清HBVDNA载量的动态监测需重视以下三点：

1.HBVDNA载量检测手段的敏感性

2.检测技术的可靠性和稳定性

3.监测的间隔时间HBV基因型耐药监测时机非必须不主张常规、广泛应用基因型耐药相关变异的命名基因型耐药相关变异

在HBV多聚酶序列中的位置HBV基因型耐药的主要技术碱基序列分析法直接测序克隆测序聚合酶链式反应及限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)反向杂交分析技术（INNO—LiPA）基因芯片技术实时荧光定量PCR技术探针定点突变PCR技术引物末端碱基定点突变扩增技术熔解曲线法基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)直接测序法末端终止法化学裂解法DNA测序自动化使用特异性引物与单链模板DNA退火，在DNA聚合酶作用下进行延伸反应，用ddNTP终止，用PAGE区分长度仅相差1个核苷酸的ssDNA，从而完成测序的方法。用化学试剂在A、G、C、T处特定的裂解DNA片段，产生一簇各种长度的短链，经过PAGE放射自显影可直读DNA顺序。类似末端终止法，所不同的是用荧光染料标记，计算机自动读出。优点简便、迅速、应用广泛。不需酶促反应，可以对寡核苷酸测序。①简便、快速、准确可靠。②安全、无放射性污染。③模板用量大大减少。④测序能力增强。HBVDNA>105copies/ml限制性内切核酸酶的作用二、各种耐药检测技术及评价JKoreanMedSci2004;19:541-546.JKoreanMedSci2004;19:541-546.突变株比例小于20%时，由于竞争抑制作用不能被扩增。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)GTACNNNPCR-RFLP检测HBVYMDD变异不要过分依基因型耐药检测技术细胞外HBV聚合酶活性分析2Informationcontentisconsideredasameasureofatest’sabilitytoprovidebroad,relevantinformationaboutpossiblenewmutations.基因型耐药相关变异的命名特异性好需要多条荧光探针，成本高YMDD自然变异的几组数据HBVYMDD变异直接测序结果图谱直接DNA测序的局限性1.

设备贵、技术高、耗材、费时。2.必须有充足目的基因片段。3.突变株比例小于20%时，由于竞争抑制作用不能被扩增。直接测序法检测HBVYMDD变异克隆测序法克隆测序法优点：

1.有助于发现混合株并可大致确定不同序列毒株之间的相对比。

2.提高了检测的灵敏度。局限性：

1.技术难度较高。

2.检测周期更长。

3.检测的费用大大增加。

碱基变异可能导致：①原有位点消失②产生新的位点③识别位点移位

利用错配引物使PCR产物中产生特异的酶切位点结果:酶切片段长、短变化和多、少变化聚合酶链式反应及限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)限制性内切核酸酶的作用它们能识别DNA的特异序列，并在识别序列内或其旁切割双链DNA。如：NdeI限制酶的识别序列和切割位点：CA

TATGGTATACNlaIll限制酶的识别序列和切割位点：CATGNNNGTACNNNPCR-RFLP检测HBVYMDD变异PCR错配引物设计PCR-RFLP检测HBVYMDD变异PCR-RFLP检测HBVYMDD变异PCR-RFLP技术的评价优点：简单、广泛易开展。缺点：

1.限制性内切酶种类有限。

2.错配引物将导致退火温度降低、非特异条带增多。

3.引物非完全匹配，可能导致扩增效率降低、检测敏感的下降。

反向杂交分析技术（INNO—LiPA）INNO—LiPA诊断HBVYMDD变异DNA芯片技术BiologicalSampleAnalyzedataScannermicroarray“Hybridize”arrayerMicroarrayfabricationSamplepreparationMolecularhybridizationDetectionandanalysisDNA芯片技术诊断HBVYMDD变异DetectionofYMDDMotifMutantsbyOligonucleotideChipsinLamivudine-UntreatedPatientswithChronicHepatitisBVirusInfection。JKoreanMedSci2004;19:541-546.DNA芯片技术优点局限性大通量技术和设备的要求高快速检测成本高灵敏度高可平行检测

实时荧光定量PCR在基因变异中的应用探针定点突变PCR技术Taqman-MGB探针引物末端碱基定点突变扩增技术高分辨熔解曲线法Taqman-MGB探针定点突变PCR技术Taqman-MGB探针技术检测YMDD变异HBVDNA>105copies/mlW:M=1:1HBVDNA>105copies/mlW:M=10:1HBVDNA<105copies/mlW:M=10:1：W：M探针定点突变PCR技术

优点不足

灵敏度高需要相对较贵的荧光PCR仪特异性好需要多条荧光探针，成本高费时短影响因素多，存在一定误判引物末端碱基定点突变扩增技术引物末端碱基定点突变扩增技术

检测YMDD变异熔解曲线法检测YMDD变异特异性探针，其Tm值不同溶解曲线分析HBVDNA<105copies/ml检测技术的可靠性和稳定性DetectionofYMDDMotifMutantsbyOligonucleotideChipsinLamivudine-UntreatedPatientswithChronicHepatitisBVirusInfection。碱基变异可能导致：Taqman-MGB探针定点突变PCR技术HBVMDD变异与病毒学突破引物末端碱基定点突变扩增技术优点局限性指在核苷类药物治疗过程中血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平一度复常，但在继续治疗中血清ALT水平又再次升高。该技术在操作上非常繁琐，目前仅限于研究之需，主要用于药物开发研究，尚不能用于常规临床分析。细胞外HBV聚合酶活性分析MALDI-TOFMS检测

HBVYMDD变异的原理HBV表型耐药（phenotypicresistance）HBVDNA载量检测手段的敏感性不要过分依基因型耐药检测技术基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)原理MALDI-TOFMS检测

HBVYMDD变异的原理基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)优点：高灵敏度、准确度、分辨率能发现相对比例小于1%的变异株。局限性：设备昂贵，目前国内难以用于临床检测。HBV耐药不同检测技术的比较AdvancesinMolecularDiagnosisofHBVInfectionandDrugResistance。Int.J.Med.Sci.20052(1)：8-161Sensitivityherereferstothelowestlevel(%)atwhichanassaycandetectmixturesofmutantandwild-typevirus.2Informationcontentisconsideredasameasureofatest’sabilitytoprovidebroad,relevantinformationaboutpossiblenewmutations.3Updateabilityassessestheeaseatwhichatestcanbedaptedtoincorporatethedetectionofanewmutation.na,notapplicable.nd,notdetermined.HBV表型耐药检测有两种途径：1.细胞外HBV聚合酶活性分析。2.细胞药物敏感性实验。细胞外HBV聚合酶活性分析目前常用的研究HBV聚合酶活性模型是将HBV基因组插入杆状病毒载体，继而转染昆虫细胞而表达HBV颗粒，应用亲和层析法纯化HBV颗粒后，在细胞外评价药物对聚合酶活性的影响。引物末端碱基定点突变扩增技术

检测YMDD变异不要过分依基因型耐药检测技术。用化学试剂在A、G、C、T处特定的裂解DNA片段，产生一簇各种长度的短链，经过PAGE放射自显影可直读DNA顺序。之间的相对比。二、各种耐药检测技术及评价基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)DNA芯片技术诊断HBVYMDD变异MALDI-TOFMS检测

HBVYMDD变异的原理反向杂交分析技术（INNO—LiPA）DetectionofYMDDMotifMutantsbyOligonucleotideChipsinLamivudine-UntreatedPatientswithChronicHepatitisBVirusInfection。病毒学突破（virologicbreakthrough）基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)用化学试剂在A、G、C、T处特定的裂解DNA片段，产生一簇各种长度的短链，经过PAGE放射自显影可直读DNA顺序。临床耐药（clinicalresistance）PCR-RFLP技术的评价细胞外HBV聚合酶活性分析细胞药物敏感性实验该方法类似于细菌药物敏感试验。目前多采用病毒载体将含有被检测的含HBV变异位点的全基因组导入肝细胞源性细胞株，然后将各种浓度的核苷类药物加入培养液，经过一定时间培养后检测细胞上清中的HBVDNA