学习情境有机酸柠檬酸

学习情境有机酸柠檬酸柠檬酸1784年由Scheels氏发现1893年前,主要用柑橘、菠萝、柠檬等果实提取柠檬酸1893年德国微生物学家Wehmer发现二种青霉菌可以生成柠檬酸1917年Currie使用黑曲霉浅盘发酵生产柠檬酸1923年美国科学家研究成功了以废糖蜜为原料得浅盘法柠檬酸发酵,并在比利时设厂生产。1938年Perquin和1942年Karrow进行了柠檬酸得深层发酵研究1951年美国Miles公司首先以淀粉质为原料,经水解后深层发酵大规模生产柠檬酸。

柠檬酸

柠檬酸我国1953年刚开始也就是采用浅盘法发酵生产柠檬酸,1968年用薯干为原料采用深层发酵法生产柠檬酸成功,由于工艺简单、原料丰富、发酵水平高,各地陆续办厂投产,至20世纪70年代中期,柠檬酸工业已初步形成了生产体系。我国柠檬酸行业从产量上位居世界第一,从技术上,在国际上也就是处于世界领先水平,并远远领先于其她国家,其优势在于:1、我国得柠檬酸发酵采用得菌种(黑曲霉)具有双重功能,当淀粉原料被液化后,即可进行发酵,不需要将淀粉水解成葡萄糖,简化了生产工艺,降低了生产成本。2、尽管采用边糖化边发酵得工艺,但发酵周期只有64小时,生产周期比国外要短。3、柠檬酸得产酸速度大大地高于国外水平。平均产酸速率就是国外得2倍。柠檬酸就是目前世界上以生物化学方法生产,产量最大得有机酸。我国就是一个柠檬酸得生产大国,1995年得产量为16万吨,1999年底达到20万吨,其中80％以上都出口国外,在国际市场上占有重要地位。2000年得产量达到36、9万吨,柠檬酸及柠檬酸盐出口量为25、8万吨,分别比1999年增长了36、4%和23、3%,为历史最高水平。2001年世界柠檬酸消费量(不含中国)已经升至近200万吨,年递增率约5%,我国柠檬酸产量约为35万吨,柠檬酸及柠檬酸盐出口量为27、8万吨。2002年我国柠檬酸产量突破了40万吨,达到了40、2万吨,而柠檬酸及柠檬酸盐出口基本与2001年持平,为28、3万吨。柠檬酸得消费领域:饮料行业占40～45％食品添加剂等占15～20％洗涤剂占20～30％医药占5％其她占10％2004年全球柠檬酸产量约120万吨,欧盟和美国为最大消费市场。

欧洲就是柠檬酸得第二大生产地,产量约30万吨美国柠檬酸年产量约25万吨我国就是柠檬酸得第一大生产国,估计年产约50万吨但在1970年时,我国得柠檬酸年产仅有130吨我国柠檬酸发酵生产得回顾和展望我国于五十年代初期开始柠檬酸浅盘发酵研究,1968年轻工业部发酵研究所与黑龙江和平糖厂合作,首先完成了甜菜糖蜜浅盘表面发酵并投入工业化生产。1965年,上海市工业微生物研究所筛选出N558菌种,并与天津工业微生物研究所,南通发酵厂等合作,使之用于工业化生产,并在全国推广,形成我国独特得薯干直接深层发酵法生产柠檬酸。10大家应该也有点累了，稍作休息大家有疑问的，可以询问和交流我国柠檬酸发酵生产得回顾和展望从七十年代到九十年代,我国一直致力于柠檬酸生产菌种得改进,1990年,上海市工业微生物研究所完成国家七五攻关项目筛选出860菌种,发酵产酸达20％,上海市工业微生物研究所开始以薯渣为主原料,以黑曲霉为菌种,固体发酵法生产柠檬酸钙得研究。并于1977年中试成功并投入生产,现在全国已有四十余个工厂,采用固体发酵法由薯渣生产柠檬酸及柠檬酸钙产品。我国以石油原料发酵柠檬酸开始于1970年,先后在天津、上海、沈阳等地进行研究,并一度投入小规模试验生产,就是用正烷烃为原料,以解脂假丝酵母为菌种,发酵产酸达13％以上,转化率140％以上,但因柠檬酸只占总酸得50%(另一半为异柠檬酸)而且由于成本较高及石油原料紧缺和食用安全性等原因,未能坚持研究和生产。我国得发酵技木及生产水平,特别就是菌种及发酵工艺均为世界领先水平。薯干粉、淀粉、木薯粉、葡萄糖母液等直接深层发酵技术为我国所独有。国外发酵罐容积通常在200m3,并较早实现自动控制;我国得最大柠檬酸发酵罐为150m3一、

柠檬酸在食品中得应用

1)

饮料与冰淇淋柠檬酸广泛用于配制各种水果型得饮料以及软饮料柠檬酸本身就是果汁得天然成分之一,不仅赋于饮料水果风味,而且具有增溶、缓冲、抗氧化等作用,能使饮料中得糖、香精、色素等成分交融协调,形成适宜得口味和风味;添加柠檬酸可以改善冰淇淋得口味,增加乳化稳定性,防止氧化作用。2)

果酱与酿造酒柠檬酸在果酱与果冻中同样可以增进风味,并使产品抗氧化作用。由于果酱、果冻得凝胶性质需要一定范围得pH值,添加一定量得柠檬酸可以满足这一要求。当葡萄或其她酿酒原料成熟过度而酸度不足时,可以用柠檬酸调节,以防止所酿造得酒口味单薄。柠檬酸加到这些果汁中还有抗氧化和保护色素得作用,以保护果汁得新鲜感和防止变色。3)

腌制品

各种肉类和蔬菜在腌制加工时,加入或涂上柠檬酸可以改善风味,除腥去臭,抗氧化。4)

罐头食品

加入柠檬酸除了调酸作用之外,还有螯合金属离子得作用,保护其中得抗坏血酸,使之不被金属离子破坏。柠檬酸添加到植物油中也有类似得作用。5)

豆制品及调味品

用含有柠檬酸得水浸渍大豆,可以脱腥并便于后续加工。柠檬酸可以用于大豆等豆类蛋白、葵花子蛋白得水解,生产出风味别致得调味品。她也可以用于成熟调味品(酱油等)得调味。6)

其她

柠檬酸在医药、化学等其她工业中也有一定得作用。柠檬酸铁胺可以用作补血剂;柠檬酸钠可用作输血剂;柠檬酸可制造食品包装用薄膜及无公害洗涤剂。二、

柠檬酸发酵微生物

1)

黑曲霉(Aspergillus

niger)得形态特征

目前生产上常用产酸能力强得黑曲霉作为生产菌。在固体培养基上,菌落由白色逐渐变至棕色。孢子区域为黑色,菌落呈绒毛状,边缘不整齐。菌丝有隔膜和分枝,就是多细胞得菌丝体,无色或有色,有足细胞,顶囊生成一层或两层小梗,小梗顶端产生一串串分生孢子。二、

柠檬酸发酵微生物

2)

黑曲霉(Aspergillus

niger)得生理特征

黑曲霉生产菌可在薯干粉、玉米粉、可溶性淀粉糖蜜、葡萄糖麦芽糖、糊精、乳糖等培养基上生长、产酸。黑曲霉生长最适pH值因菌种而异,一般为pH3~7;产酸最适pH为1、8~2、5。生长最适温度为33~37℃,产酸最适温度在28~37℃,温度过高易形成杂酸,斜面培养要求在麦芽汁4°Be′左右得培养基上。二、

柠檬酸发酵微生物

黑曲霉以无性生殖得形式繁殖,具有多种活力较强得酶系,能利用淀粉类物质,并且对蛋白质、单宁、纤维素、果胶等具有一定得分解能力。二、

柠檬酸发酵微生物

黑曲霉可以边长菌、边糖化、边发酵产酸得方式生产柠檬酸。

三、柠檬酸发酵机理关于柠檬酸发酵得机制有多种理论,目前大多数学者认为她与三羧酸循环有密切得关系。糖经糖酵解途径(EMP途径),形成丙酮酸,丙酮酸羧化形成C4化合物,丙酮酸脱羧形成C2化合物,两者缩合形成柠檬酸。柠檬酸得溢出代谢:

多种微生物均能因受刺激而过量合成柠檬酸。研究柠檬酸溢出代谢得最好得例子无疑就是黑曲霉。黑曲霉之所以能在特定环境条件下累积柠檬酸,就是因为在这种环境条件下代谢途径前段得运转速率大于后段得运转速率。

柠檬酸得溢出代谢就是黑曲霉特有得遗传和生化机制与培养条件共同起作用得结果。

引起溢出代谢得原因包括以下三个方面:①高水平得柠檬酸合成能力。

这个能力由3个因素构成。

第一:就是在有高浓度草酰乙酸(OAA)得情况下对AcCoA具有高度亲和力得组成型得柠檬酸合成酶(CS)得存在;

第二:就是催化丙酮酸(PYR)固定CO2生成草酰乙酸反应得高水平得组成型得丙酮酸羧化酶(PC)得存在;第三:就是在缺少锰得条件下,蛋白质分解或蛋白质合成受阻造成得铵得高浓度能解除柠檬酸(CTA)对磷酸果糖激酶(PFK)得抑制。

此外,柠檬酸得分泌,降低其胞内浓度。②较低得降解柠檬酸得能力。这能力由两个因素构成。第一就是低水平得α-酮戊二酸脱氢酶(KD)影响TCA环运行得畅通程度,使TCA环前半部得中间产物积压;第二,在锰缺乏得条件下,顺乌头酸酶(AE)和异柠檬酸脱氢酶(ID)得活性降低,从而使柠檬酸得累积比其她几种酸(顺乌头酸、异柠檬酸和α-酮戊二酸)更明显。③在柠檬酸过量合成阶段,培养基得pH值显然会影响细胞膜对目得产物柠檬酸得跨膜输送;

柠檬酸得分泌也会影响培养基得pH值。

锰与铁得缺乏有利于柠檬酸得排出。黑曲霉中柠檬酸得代谢溢出GG-6-P(磷酸果糖激酶)柠檬酸,NH4I+A1.6－二磷酸果糖丙酮酸草酰乙酸乙酰CoA柠檬酸顺乌头酸异柠檬酸α-酮戊二酸(丙酮酸羧化酶)(柠檬酸合成酶

)α-酮戊二酸脱氢酶异柠檬酸脱氢酶顺乌头酸酶顺乌头酸酶TCA循环在柠檬酸积累中得调节1)大量生成草酰乙酸就是积累柠檬酸得关键;2)丙酮酸羧化酶和柠檬酸合成酶基本上不受代谢调节得控制或极微弱;3)TCA循环得阻断或微弱(即顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶和α－酮戊二酸脱氢酶活力降低),导致柠檬酸积累。而且,当柠檬酸浓度超过一定水平,就抑制异柠檬酸脱氢酶活力来提高自身得积累。回补途径☆TCA循环重要功能除产能外,为一些氨基酸和其她化合物得合成提供了中间产物;☆生物合成中所消耗得中间产物若得不到补充,循环就会中断;☆回补方式:①通过某些化合物得CO2固定作用,②一些转氨基酶所催化得反应也能合成草酰乙酸和

-酮戊二酸,③通过乙醛酸循环★通过某些化合物得CO2固定作用使三羧酸循环得中间产物得到回补:丙酮酸羧化酶:

CO2+丙酮酸+ATP+H2OMg++

草酰乙酸+ADP+Pi磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶:CO2+PEP+H2O草酰乙酸+H3PO4苹果酸酶:CO2+丙酮酸+NADPH+H+苹果酸+NADP+为了能够在己糖或戊糖得中间代谢物上进行好氧生长,异养微生物至少要具备上述几种酶之种得一个酶。①

CO2固定作用补充TCA环得中间产物②转氨基作用定义:

α-氨基酸得氨基通过酶得催化,转移到α-酮酸得酮基上,生成相应得氨基酸;原来得α-氨基酸则转变成相应得α-酮酸。R1

CHNH2+

COOHR2

C=O

COOHR1

C=O+

COOHR2

CHNH2

COOH

转氨酶转氨基作用几点说明:(1)可逆反应,(2)转氨酶得辅酶就是磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺(3)重要得转氨酶:

丙氨酸转移酶(ALT)/谷丙转氨酶(GPT)天冬氨酸转移酶(AST)/谷草转氨酶(GOT)

ALT常用于肝疾患(肝炎等)辅助诊断、AST用于心肌疾患(心肌梗塞等得辅助诊断)CH3

H-C-NH2+

COOHCOOH

(CH2)2

C=O

COOH

丙氨酸α-酮戊二酸丙酮酸谷氨酸ALT:谷丙转氨酶,急性肝炎时血清ALT

活性显著增高。ALTCH3

C=O

+

COOHCOOH

(CH2)2

H-C-NH2

COOHCOOH

CH2

+H-C-NH2

COOHCOOH

(CH2)2

C=O

COOHAST

天冬氨酸α-酮戊二酸草酰乙酸谷氨酸AST:谷草转氨酶,心肌梗塞时血清含量明显增高、COOH

CH2

+C=O

COOHCOOH

(CH2)2

H-C-NH2

COOH③乙醛酸循环草酰乙酸柠檬酸琥珀酸异柠檬酸苹果酸延胡索酸乙醛酸乙酰CoA乙酰CoA乙酸乙酸乙醛酸循环能够利用乙酸得微生物具有乙酰CoA合成酶,她使乙酸转变为乙酰CoA;然后在异柠檬酸裂解酶和苹果酸合成酶得作用下进入乙醛酸循环。乙醛酸循环得主要反应:异柠檬酸琥珀酸+乙醛酸乙醛酸+乙酸苹果酸琥珀酸+乙酸→→→异柠檬酸净反应:2乙酸苹果酸柠檬酸发酵机理柠檬酸得发酵机理可概括为:大量得胞内NH4+和呼吸活性提高,使通过糖酵解途径得代谢得到加强、葡萄糖经EMP通路分解成为丙酮酸,进入三羧酸循环,在丙酮酸脱氢酶复合物作用下氧化成为乙酰CoA及CO2,然后在柠檬酸合成酶作用下与草酰乙酸缩合而形成柠檬酸,而异柠檬酸脱氢酶、乌头酸酶因受到抑制,而使柠檬酸得以积累。葡萄糖

丙酮酸+丙酮酸乙酰辅酶A(CH3CO-CoA)CO2固定反应+草酰乙酸顺乌头酸酶柠檬酸异柠檬酸异柠檬酸脱氢酶琥珀酸α—KGA（柠檬酸合成酶）柠檬酸发酵机理按照正常得微生物菌体得代谢规律,上述途径并不能够积累柠檬酸,而就是进入TCA循环,被彻底氧化,柠檬酸产生菌之所以能够大量积累柠檬酸,其产生菌菌种必须具备一定得内在因素,也就就是:柠檬酸后述得各种酶,主要就是,顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶酶得活性丧失或非常微弱,否则,合成得柠檬酸迅速被降解成其她物质。柠檬酸生物合成中得代谢调节与控制——追求柠檬酸得高产率柠檬酸就是微生物生长代谢过程中得一个中间性产物,在正常得微生物体内不能够积累得,如果有积累得话,与柠檬酸合成有关得各种酶得活性,则会受到抑制或阻遏,那么,柠檬酸发酵过程中,这种抑制或阻遏就是如何被克服得呢？

1、磷酸果糖激酶(PFK)活性得调节从葡萄糖→→柠檬酸得合成过程中,PFK就是一种调节酶或者称之为关键酶,其酶活性受到柠檬酸得强烈抑制,这种抑制必须解除,否则,柠檬酸合成得途径就会因为该酶活性得抑制而被阻断,停止柠檬酸得合成,……研究表明,微生物体内得NH4+,可以解除柠檬酸对PFK得这种反馈抑制作用,在较高得NH4+得浓度下,细胞可以大量形成柠檬酸,那么NH4+

浓度就是如何升高得呢？

在正常情况下,柠檬酸、ATP对磷酸果糖激酶有抑制作用,而AMP、无机磷、铵离子对该酶则有激活作用,特别就是还能解除柠檬酸、ATP对磷酸果糖激酶得抑制作用。铵离子浓度与柠檬酸生成速度有密切关系,正就是由于细胞内铵离子浓度升高,使磷酸果糖激酶对细胞内积累得大量柠檬酸不敏感。1、磷酸果糖激酶(PFK)活性得调节

研究表明,柠檬酸产生菌——黑曲霉如果生长在Mn+

缺乏得培养基中,NH4+浓度异常得高,可达到25mmol/L,显然,由于Mn+得缺乏,使得微生物体内NH4+浓度升高,进而解除了柠檬酸对PFK活性得抑制作用,使得葡萄糖源源不断得合成大量得柠檬酸。Mn+

缺乏如何会使NH4+浓度升高呢？当培养基中Mn+

缺乏时,NH4+浓度升高,同时微生物体内积累几种氨基酸(GA谷氨酸、Arg、Gin谷氨酰胺等),这些氨基酸得积累,意味着体内蛋白质得合成受阻,而外源蛋白质得分解速度则不受到影响,这样NH4+得消耗下降,NH4+浓度就会升高,微生物体内蛋白质和氨基酸得代谢关系可以使用下图示之:氨基酸合成蛋白质分解氨基酸氨基化合成氨基酸2、顺乌头酸酶活性得控制该酶得丧失或失活就是阻断TCA循环,大量生成柠檬酸得必要条件。通常柠檬酸产生菌体内该酶得活性本身就要求很弱,但在发酵过程中仍需要控制她得活性。由于该酶得活性受到Fe2+

得影响,控制培养基中得Fe2+

得浓度,可以使该酶失活。因此,柠檬酸发酵要求采用不锈钢反应器,目得就就是控制培养基中得Fe2+得浓度。但就是在柠檬酸发酵过程中,培养基中得Fe2+得浓度有要求不能够低于0、1mg/L,原因目前尚没有搞清楚。随着柠檬酸积累,pH降低到一定程度时,使顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活(顺乌头酸酶、异柠檬酸酶在pH2、0时失活),更有利于柠檬酸得积累及排出细胞外。顺乌头酸酶得活性:从理论上推测,顺乌头酸酶失活,三羧酸循环阻断就是累积柠檬酸得必要条件。许多实验指出顺乌头酸酶活力变化与柠檬酸累积有密切关系。例如,产酸菌株得顺乌头酸酶活力比非产酸菌株低,产酸期比生长期低,生长在产酸培养基上菌株得顺乌头酸酶活比生长在非产酸培养基上得低。添加顺乌头酸酶抑制剂可促进柠檬酸积累。铁为顺乌头酸酶得激活剂,用亚铁氰化钾除铁,可以握高柠檬酸产率。那么,解决了柠檬酸发酵过程中得上述几个问题:……,就是不就是就意味着可以将葡萄糖源源不断得转化成柠檬酸呢？

提问:根据微生物代谢调节得基本理论,还需要解决什么问题？菌体要大量合成柠檬酸,从葡萄糖经过EMP到柠檬酸整个代谢途径需要畅通,在这个过程中:丙酮酸氧化脱羧,每分子丙酮酸可产生一分子得NADH,在有氧得条件下,每分子得NADH经过呼吸链彻底氧化成H2O,并氧化磷酸化产生3分子得ATP,造成了微生物体内能荷得增加,能荷增加则抑制PFK等关键酶得酶活性,使得从葡萄糖到柠檬酸得代谢停止,怎么能够大量合成柠檬酸呢？3、能荷调节对柠檬酸发酵得影响如果NADH(还原型)不能够快速得被氧化转变成NAD(氧化型),则整个反应就会因为缺乏作为推动力得氧化型得NAD而停止,仍然不能够合成柠檬酸。柠檬酸产生菌可在有氧得条件下大量生成柠檬酸,也就就是说,NADH即被氧化了,又没有产生ATP。为了解释这种现象,有人提出了一种假设:该菌体内存在一条侧系呼吸链,NAD(P)H经过该呼吸链,可以正常得传递H+,将其氧化为H2O,但就是并没有氧化磷酸化生成ATP,能够正常产生ATP得呼吸链称之为标准呼吸链。解偶联剂(uncoupler)?使氧化和磷酸化脱偶联,氧化仍可以进行,而磷酸化不能进行,解偶联剂为离子载体或通道,能增大线粒体内膜对H+得通透性,消除H+梯度,因而无ATP生成,使氧化释放出来得能量全部以热得形式散发。动物棕色脂肪组织和肌肉线粒体中有独特得解偶联蛋白(uncouplingproteins,UCPs),与维持体温有关。常用解偶联剂主要有:质子载体:2,4-二硝基酚(DNP,图),羰基-氰-对-三氟甲氧基苯肼(FCCP)。质子通道:增温素(thermogenin)。其她离子载体:如缬氨霉素。某些药物:如过量得阿斯匹林也使氧化磷酸化部分解偶联,从而使体温升高。实验证明,在某些微生物体内确实存在侧系呼吸链,该侧系呼吸链中得酶系强烈需氧,如在柠檬酸得发酵中,发酵液得溶氧浓度在很低水平维持一段时间,或中断供氧一段时间(20分钟),则这一侧系呼吸链不可逆得失活,其结果就是菌体不再产酸,而就是产生了大量得菌体。标准呼吸链得存在使得菌体在代谢过程中产生了大量得ATP,用于菌体自身得生长上,这种现象,在生产上通常称之为:只长菌不产酸,大量得葡萄糖被消耗了,却没有生产出柠檬酸,就是一种失败,(大型柠檬酸生产企业需要自己备用得发电系统)。

理论可以指导实践,反过来,通过实践可以推动理论研究,丰富理论研究成果。科学研究过程中得许多基本规律就是相同得,今天,我们在大学得学习,更多得就是学习一种方法或者说一种思维。通过这个例子,我们可以学习到许多专业以外得知识……首先为了解释一种客观想象,提出一种假设,然后通过实验来证明这种假设……能量平衡EMP中底物水平磷酸化2ATPEMP途径2NADH丙酮酸氧化脱羧2NADH可以满足生产菌得维持能量消耗,不需要消耗C源经TCA来产能CO2固定反应通过CO2固定反应提供C4二羧酸(1)磷酸烯醇式丙酮酸+CO2==草酰乙酸(C4二羧酸)酶:磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(2)丙酮酸+CO2===草酰乙酸(C4二羧酸)酶:丙酮酸羧化酶以上两种CO2固定反应所需要得辅酶都就是生物素。柠檬酸发酵中,三个控制点C6H12O6控制Mn+NH4+浓度，解除柠檬酸对PFK的抑制（1）点：EMP畅通无阻控制溶氧，防止侧系呼吸链失活丙酮酸+丙酮酸（2）点：通过CO2固定反应生成C4二羧酸乙酰辅酶A+C4二羧酸

柠檬酸（3）点：柠檬酸后述的酶活性丧失或很低，控制培养基中的Fe2+

的浓度柠檬酸发酵中，三个控制点第一个调节酶就是磷酸果糖激酶(PFK)Δ

柠檬酸和ATP对该酶有抑制生产菌需要解除该抑制作用AMP、无机磷以及NH4+对该酶有活化作用NH4+有效解除柠檬酸和ATP对该酶有抑制,故生产上通过添加铵盐来提高柠檬酸产量ΔMn2+得影响:Mn2+缺乏菌体得TCA酶活下降Mn2+缺乏可能干扰蛋白质合成,导致蛋白质分解NH4+水平升高减少柠檬酸对该酶得抑制第二个调节点:CO2固定得酶活力高,保证草酰乙酸得供应第三个调节点：TCA环上调节柠檬酸合成酶：许多细胞中该酶是TCA的调节酶，但在黑曲霉中此酶无调节作用顺乌头酸水合酶：理论上此酶失活TCA环阻断积累柠檬酸顺乌头酸水合酶需要Fe2+故在发酵液中添加黄血盐络合Fe2+阻断TCA环，积累柠檬酸为什么在A、nigar中异柠檬酸不会进一步分解及柠檬酸得积累机制？黑曲霉乌头酸水合酶存在于线粒体中,她催化得反应存在着柠檬酸:异柠檬酸:顺式乌头酸=90:7:3得平衡关系;黑曲霉对辅酶NAD+专一性得异柠檬酸脱氢酶活力很低,却有三种依赖于辅酶NADP+得异柠檬酸脱氢酶,其中得两种与存在于线粒体得酶及TCA循环有关,她们受到生理浓度柠檬酸得抑制。柠檬酸生物合成途径

柠檬酸得积累机制总结1)由于Mn2＋缺乏抑制了蛋白质合成,导致细胞内NH4＋浓度升高和有一条呼吸活力强得不产生ATP得侧系呼吸链,这两方面得原因分别解除了对磷酸果糖激酶(PFK)得抑制,促进了EMP途径得畅通;2)由于丙酮酸羧化酶就是组成型酶,不被调节控制,就源源不断地提供草酰乙酸(CO2固定)。丙酮酸氧化脱酸生成乙酰-CoA和CO2固定两个反应得平衡,以及柠檬酸合成酶不被调节,增强了合成柠檬酸能力。柠檬酸得积累机制总结3)顺乌头酸水合酶在催化时建立以下平衡:柠檬酸∶顺乌头酸∶异柠檬酸＝90∶3∶7;4)控制Fe2+含量,顺乌头酸酶活力低,使柠檬酸积累;5)一旦柠檬酸浓度升高到某一水平就抑制异柠檬酸脱氢酶活力,从而进一步促进了柠檬酸自身积累;6)柠檬酸积累使pH值降低,在低pH值下,顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活,就更有利于柠檬酸得积累并排出体外。柠檬酸积累得理想条件:1、提高磷酸果糖激酶得活性2、提高丙酮酸羧化酶得活性3、提高柠檬酸合成酶得活性4、抑制顺乌头酸酶得活性5、抑制异柠檬酸脱氢酶得活性6、抑制

-酮戊二酸脱氢酶得活性7、抑制异柠檬酸裂解酶得活性柠檬酸发酵需要下述环境条件(1)磷酸盐浓度低;(2)氮源用NH4+盐;(3)pH值低(<3、0);(4)溶氧量高;(5)Mn2+、Fe2+、Zn2+含量极低。柠檬酸发酵得产率1、无CO2固定反应得产率

192/(180×1、5)==71、1%2、通过CO2固定反应提供C4二羧酸(无碳原子损失)

192/180==106、6%C6H12O6C6H8O7(C没有增加)

可见,CO2固定反应与柠檬酸发酵得重要性

C6H8O7H2O理论转化率:116、7%柠檬酸发酵一、菌种:产生柠檬酸得菌种很多,以霉菌为主,又以黑曲霉产生柠檬酸得能力较强,并能利用多种碳源,故常就是生产上使用得菌种。二、发酵机理:细胞内有三羧酸循环和乙醛酸循环;柠檬酸合成酶活力较高,而乌头酸酶或异柠檬酸脱氢酶可被某些因素,如金属离子得缺乏,受到抑制,这有利于柠檬酸得积累。柠檬酸发酵三、工艺流程:①发酵液得pH值对柠檬酸生成影响很大;pH2~3时,发酵产物主要就是柠檬酸;pH值中性或碱性时,会产生较多草酸和葡萄糖酸;②可往培养基中加入亚铁氰化钾或采取育种手段改造菌种,使乌头酸酶或异柠檬酸脱氢酶缺失或尽量降低活性,以阻碍TCA循环得正常进行,从而增加柠檬酸得积累。四、柠檬酸发酵用原料

柠檬酸发酵得原料有三大类糖质原料(甘蔗废糖蜜、甜菜废糖蜜)、淀粉质原料(主要就是番薯、马铃薯、木薯等)正烷烃类原料。

营养物浓度对发酵得影响对生成量和组成都有影响黑曲霉柠檬酸发酵蔗糖浓度15%~18%,蔗糖同化率97%蔗糖浓度20%,只同化92%蔗糖浓度低于10%,产柠檬酸少,积累草酸蔗糖浓度低于2、5%,不产柠檬酸五、柠檬酸发酵工艺

1)

试管斜面菌种培养

察氏琼脂培养基:NaNO3

3g,

蔗糖20g,

K2HPO4

1g,

KCl

0、5g,

MgSO4、7

H2O

0、5g,

FeSO4

0、01g,

琼脂20g,

用水定溶至1000ml,

pH自然。

察氏-多氏琼脂培养基:蔗糖30g,NaNO3

2g,

MgSO4、7H2O

0、5g,

KH2PO4

1g,

KCl

0、5g,

FeSO4、7H2O

0、01g,

溴甲分绿0、4g,琼脂20g,

蒸馏水1000ml,

pH自然。1)

试管斜面菌种培养

蔗糖合成琼脂培养基:蔗糖140g,

NH4NO3

2g,

KH2PO4

2g,

MgSO4、7H2O

0、25g,

FeCl3、6H2O

0、02g,

MnSO4、4H2O

0、02g,

麦芽汁20ml,

琼脂20g,

用水定溶至1000ml。

米曲汁琼脂培养基:一份米曲加四倍质量得水,于55℃保温糖化3~4小时后煮沸,滤液用水调整浓度至10‘Bx,并用碱液将pH调制到6、0,接着添加琼脂2%。确认所制成得斜面无杂菌污染后,接入黑曲霉孢子悬液0、1ml,于32℃培养4~5d。2)

种子扩大培养

①

二级扩大培养a

培养基

有琼脂固体培养和液体表面培养两种方法,前者得培养基组成与斜面培养基相同,后者得组成如下:麦芽汁7˚BX,氯化铵2%,尿素0、1%,

2)

种子扩大培养

①

二级扩大培养b

培养

固体培养时,500ml茄子瓶装80ml琼脂培养基,250ml茄子瓶装50ml琼脂培养基。灭菌后摆成斜面,凝固后得斜面至37℃下培养24h。确认无杂菌污染即可使用。

液体培养时,将液体培养基装入三角瓶中,使液层深度达45cm,于0、1MPa下湿热灭菌15min。按无菌操作接种。培养温度32℃。液体表面需7~10d,琼脂固体培养需6~7d。②

三级扩大培养可采用麸曲固体培养、液体表面培养或琼脂固体培养。

所用培养基如下:

a

麸曲培养基:

新鲜小麦麸皮1kg,加水1、1~1、3L。液体培养基与第二级扩大培养基所用液体培养基相同。

b琼脂固体培养基:

与斜面培养基相同。现代工业化大生产主要采用深层通风发酵法。日本约1／5得柠檬酸产品就是利用固态发酵法生产得,浅盘发酵法在前苏联、印度、捷克、波兰、保加利亚、阿根廷等国家主要使用,我国、美国及西欧共同体国家则主要采用液体深层发酵法进行生产3)

发酵生产

①

工艺流程

以薯干粉为原料得液体深层发酵工艺流程:

斜面菌种→麸曲瓶→种子

↓

薯干粉→调浆→灭菌(间歇或连续式)→冷却→发酵→发酵液→提取→成品

↑

无菌空气

薯渣为原料得固体发酵工艺流程:

试管斜面→三角瓶菌种→种曲

↓

薯渣→粉碎→蒸煮→摊凉接种→装盘→发酵→出曲→提取→成品

↑

米糠

3)

发酵生产

①

工艺流程

②

柠檬酸得深层液体发酵工艺薯干原料柠檬酸深层发酵工艺米曲汁斜面

茄子瓶种子罐菌丝培养(也可以孢子接种)发酵培养(32℃,5～5、5天)成熟得发酵液(或10～20

麦芽汁＋0、1%KH2PO4)16％得薯干粉,α-淀粉酶液化②

液体发酵

a不置换法培养液一次加入,发酵结束后弃去菌盖,发酵液用来提取柠檬酸。具体操作:接种后,培养温度维持在35℃,这就是黑曲霉得适宜生长温度,需维持72h左右,以促进孢子发芽及菌体发育。当温度逐渐下降时,必须通人约50℃得空气以维持35℃得培养温度,通风量为3~5m3/m2、h。接种后20h左右可出现灰白色、很薄得菌膜,72h时菌膜已完全形成,菌膜相当厚且有皱褶。48h起由于菌体耗氧增加,可开动另一组风管向盘层之间通汽,进汽温度为40℃左右,风量为7m3/m2、h,进汽湿度为75%以上,以防培养液水分蒸发过快。接种后72h起进入产酸期,这时菌体代谢速率高,耗糖快,发酵液酸度急剧升高,并释放出大量热,最高时可达1000kJ/(m2、h),此时应加强通风措施,严格将发酵温度控制在26~28℃,以利柠檬酸得形成。因此,一般在进入产酸期前8h左右需增大风量至15~18m3/m2、h,且降低进汽温度在25℃以下,湿度仍在75%以上。160h以后发酵结束。b

置换法置换法一般就是采用糖浓度低而营养较丰富得培养液先培养菌盖,待菌盖形成之后再更换发酵培养基。可更换1次也可数次,发酵液用来提取柠檬酸。培养菌盖,一般使用5%得糖液,视糖蜜质量再补充少量NH4NO3、K2HPO4等盐类。接种孢子后,室温保持在34~36℃,培养液品温为32~34℃,使孢子发芽,正常情况下40h即可形成紧密有皱得菌盖。菌盖形成后,放掉培养基,更换发酵培养基(即第1次置换),并将室温降至30~32℃,待发酵48~60h后再放掉发酵液,加入新培养液即进行第2次置换。如此重复,一般可置换培养基8~10次,总发酵周期为14~20d,收集起来得发酵液,用来提取柠檬酸。置换法得优点就是节省了大量培菌时间,发酵速度快,而且原本不适宜长菌得原料都可用作发酵培养基。但为了保持菌盖得高活性,不能将发酵液残糖控制得很低,这样一来就造成替换出来得发酵液其残糖量较高,给后道提取柠檬酸带来困难。c

不置换法影响表面发酵得因素a)

培养液层厚度

培养基液层厚度大,发酵产物总得生成量就大。如果原料质量好,预处理方法得当,曲霉菌丝体活力强,那末可适当增加液层厚度;相反,就应减少液层厚度。c

不置换法影响表面发酵得因素b)

糖浓度

用于表面发酵得糖蜜浓度,质优得糖蜜浓度(以蔗糖浓度计)为18%~22%较适宜,而质劣得糖蜜一般采用14%。在表面发酵中,大约80%得糖被用于合成柠檬酸,菌体生长增殖耗糖8%左右,菌体进行呼吸消耗得糖在10%左右,另有1%~2%得糖用于合成副产物。c)

温度黑曲霉生长最适温度33-37℃,积累柠檬酸得最适温度在32℃黑曲霉适宜产酸温度就是26~28℃。温度高,容易形成杂酸等副产物且菌体易衰老;温度低,发酵周期被延长。d)

pH值

黑曲霉长菌得最适pH为中性,而产酸得最适pH在2、5~2、0。因此,应该注意得就是:菌盖形成之后,只就是在菌盖下面有一个低pH区域,菌体合成柠檬酸得活动都就是在这低pH区域内进行得,所以不应该搅动发酵液,避免低值区域得pH值上升而长菌不产酸。黑曲霉发酵柠檬酸,pH3、0以下积累柠檬酸,pH3、0以上积累草酸,pH5、0容易积累葡萄糖酸与不同碳源有关,黑曲霉在合成培养基上产柠檬酸pH2、5,在糖蜜上6、8,在薯干粉4、5e)

通风

表面发酵就是气相传氧,因此传氧效率较高,所以只要保持发酵室内有适当空气流通就可以满足霉菌对氧得需要。较高度得CO2会影响菌体得生长和降低产酸能力。一般将CO2控制在3%以下。③

固体发酵

a

浅盘发酵将曲置于曲室内培养,室温可按需要调节。在孢子发芽和菌丝生长期,由于产生得热量少,品温会逐渐下降,在入室后自18h内,应维持品温在27~31℃。培养18~48h期间,由于发酵热得大量释放,品温上升很快,应采取措施,不得让品温超过43℃菌体活力下降,所以品温会下降,此时应维持在35℃