医学教材 白血病微小残留病灶

白血病微小残留病1精品课件InitialTherapyofAMLDiagnosisCompleteremission(CR)mustbeattainedtocurepatientCRdefinedas:Clearanceofperipheralblood&bonemarrowofleukemicblastsReconstitutionofnormalhematopoiesisResolutionofleukemicinfiltratesRemissionInductionPost-remissionTherapyConsolidationChemotherapySCT2精品课件定义Minimalresidualdisease(MRD)---微小残留病

指白血病诱导化疗完全缓解后或者骨髓移植后残留在体内少

量白血病细胞的状态,可能是导致白血病复发的根源白血病细胞负荷

初次诊断---1012形态学缓解---1010以下

分子学缓解---约106-1073精品课件AcuteleukemiaandCML

Conceptofminimalresidualdisease(MRD)10121010106CellnumberTimeMorphologicaldetectionlimitPCRdetectionlimitI4精品课件5精品课件检测MRD的意义根据细胞负荷调整缓解后化疗方案更早发现药物耐药性更早预测白血病复发评价骨髓移植净化效果为实验研究提供依据6精品课件MRD主要检测方法一、染色体核型分析二、荧光原位杂交---FISH三、流式细胞仪---FCM四、聚合酶链反应技术---PCR五、其他：细胞培养技术，免疫荧光等7精品课件染色体核型分析常用染色体显带技术检测出染色体畸变,但其成功率依赖于标本中分裂象细胞的数量多少，从而使得检测结果各不相同，且敏感度较低，约1：20

8精品课件FISHfluorescenceinsituhybridization

用荧光素标记染色体特异性探针和特异性基因的DNA探针，通过与间期细胞核DNA或中期染色体DNA原位杂交识别染色体数目和结构的异常，可以进行定性、定位和相对定量分析。优点：FISH具有安全、快速、灵敏度高、探针能长期保存、能同时显示多种颜色等优点,不但能显示中期分裂相,还能显示于间期核.

9精品课件InterphaseandmetaphaseFISHdemonstratingavariantofthePhiladelphiachromosome.Thegenesthatarerearrangedare:BCR(greenonchromosome22)/ABL(orangeonchromosome9)

ThePh’translocationappearsasdualfusion(yellow)signals.

KaryotypeshowingthePhiladelphiachromosome.

46,XX,t(9;22)(q34.1;q11.2)10精品课件Figure5:DetectionofPML-RARagenefusionbyinterphaseFISH:

Left:S-FISH(onewildtypePML,onewildtypeRARa,andoneyellowfusionsignal);

Right:D-FISH(onewildtypePML,onewildtypeRARa,andtwoyellowfusionsignals).

11精品课件RT-PCR逆转录聚合酶链反应技术利用染色体易位形成的肿瘤特异融合基因或基因重排作为分子靶，在引物作用下，通过聚合酶链反应，短时间内将特异性序列扩增百万倍，然后用凝胶电泳显示出来优点：特异性、灵敏度大大提高（可达10-5—10-6）12精品课件QRT-PCR---荧光实时定量PCR在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实现了PCR从定性到定量的飞跃，它以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为了分子生物学研究中的重要工具目前real-timeQ-PCR实验成本比较高，且各实验室标准不一，从而也限制了其广泛的应用。13精品课件流式细胞FlowCytometry测量群体中单个细胞经适当染色后其成分所发出的散射光和荧光，经染色的细胞在悬液中以单行流过高强度光源的焦点，当每个细胞经过焦点时，发出一束散射光/或荧光,经过过滤及光镜系统收集到达一个光电检测器,光检测器把散射光定量转化成电信号，经数字转换器进行数字化后而成整数，以调出显示和进行分析。造血细胞在不同分化阶段有不同的分化抗原（CD）表达。恶性肿瘤细胞可表现为抗原表达紊乱的现象如抗原的出现或消失与细胞分化水平的不同步，出现与正常细胞不同的抗原组合，即为白血病相关免疫表型多参数如四色染色技术，可用于AML\ALL\CML快速、准确、重复性好，可行定量及动态观察，敏感度可达10-4以上14精品课件MRD检测在AML中的应用评价AML治疗预后因素诱导治疗后白血病细胞负荷减少程度及达到CR时间被认为是提示预后的独立因素MRD检测目的：预示分子学复发，尽早解救治疗

15精品课件特殊遗传学改变的AML最常见的三种染色体改变及融合基因

-t(8;21)(q22;q22)AMLI-ET0

-t(15;17)(q22;q11-22)PML-RARA

-inv(16)(p13q22)/t(16;16)CBFP-MYHII*约占所有AML染色体改变的20%，具有以上改变者预后良好,但仍有10-30%治疗失败其他染色体异常t(9;11)(p21-22;q23)MLL-AF9t(9;22)(q34;q11)BCR-ABLt(6;9)(p23;q34)DEK-CAN

16精品课件APL-t(15;17)(q22;q11-22)PML-RARα

90-95%PML-RARα(+)患者在诱导或巩固治疗后阶段可达转为阴性PML-RARα持续阳性或由阴转阳则预示即将发生血液学复发巩固及维持治疗阶段监测融合基因对调整治疗方案有指导意义但是融合基因持续阴性并不代表不会复发17精品课件巩固治疗结束后MRD检测及其意义方法的标准化：在有经验的实验室，用低敏感（10-4）RT-PCR方法PML/RARα（+）定义：指在完成巩固治疗后，间隔4周的二次骨髓标本，在两个有经验的实验室证实标准方案巩固治疗：MCR可达90%-99%MDR检测结果决定后续治疗选择18精品课件UKMRCTrial——

BurnettAK，etal.Blood1999;93:4131巩固治疗结束后MRD状态与复发的关系RT-PCR（+）RT-PCR（-）PN7693yrRelapse57%27%0.00619精品课件ItalianGIMEMA-AIEOPTrial——AIDAprotocolBrecciaM,etal.Haematologica2004;89:29

23例MRD持续阳性患者挽救性治疗的结果病例数治疗时相治疗方法结果(m)3MRDCT+ABMT3inCCR(64,96,98)4MRDallo-BMT4inCCR(64,92,98,118)9血液学复发CT9diedofthedisease5血液学复发CT+allo-SCT3died;2inCCR(62,74)2血液学复发CT+ASCT2diedofthedisease结论:MRD持续阳性者宜尽早移植20精品课件维持治疗期间和以后的MRD监测MDR监测适合于高危组患者，低危组患者似乎不需要监测目前推荐：高危组患者巩固治疗后1年内每1-2个月检测1次，第2、3年每3个月1次目前常用非定量RT-PCR，Q-RT-PCR的临床应用价值有待确定，但认为动态监测融合基因定量变化可为评估预后提供有益信息，便于调整治疗方案巩固治疗后RT-PCR持续阴性与长期生存密切相关一旦转为阳性提示即将血液学复发，需及时治疗21精品课件t(8;21)(q22;q22)AMLI-ET0最为常见的AML染色体异常,见于12-15%AML患者,主要为M2b,少数见于M4和儿童ALL,并常见于年轻人可伴有其他染色体异常,最常见为X或Y染色体缺失携有该染色体的白血病细胞可分化至较成熟粒细胞,对化疗敏感性较好，是克隆性染色体异常中预后相对较好的一类，但仍有大于1/3患者最后复发监测AML1-ETO是否阳性对提示长期预后意义有限，近年来QRT-PCR定量监测其动态变化已显示出价值22精品课件Prognosticrelevanceoffusiongeneexpressionlevelsatdiagnosis.Overallsurvival(OS)andevent-freesurvival(EFS)forpatientsseparatedaccording

tothe75%-percentileoftheexpressionleveloftherespectivefusiontranscript

23精品课件inv(16)(p13q22)/t(16;16)CBFP-MYHII见于约10%AML患者，主要为M4EO带有该染色体融合基因者化疗缓解率高，但中枢神经系统白血病的发生率也较高定性测定其阳性对预后评估并无价值，甚至有矛盾结果，同AML1-ETO,定量PCR显示出对提示长期预后的作用24精品课件22号染色体9号染色体BCRABL113或14211210KD蛋白BCR-ABL基因BCR-ABLmRNAQ-PCR分子生物学异常25精品课件早期发现耐药病例反映治疗疗效的标志性指标–定量PCR（RQ-PCR）主要的疾病监测手段–用于提示细胞遗传学检查和基因突变筛选重要时间节点的检测结果为临床治疗方案的决策提供依据慢粒白血病的分子生物学检测意义26精品课件BCR-ABL转录本上升预示疾病复发6912Pre1518214.03.02.01.0基线BCR-ABL转录本对数级下降24异体造血干细胞移植后时间（月）

MCR

CCRMMRBCR-ABLdetectedBCR-ABLnotdetected3与丢失完全细胞遗传学治疗反应比较；分子生物学监测可更早提示疾病复发供体淋巴细胞回输丢失完全细胞遗传学治疗反应Ph染色体转阴27精品课件标本质量和实验室之间的标准化每个实验室独立检测并计算中位基线水平：同一批慢粒白血病治疗前标本共30例所有计算结果均与标准化的基线比较，以对数级下降形式表示28精品课件标准化的基线值计算30例初诊慢粒白血病药物治疗前取得的标本BCR-ABL/BCR%中位值：3个参考实验室结果*获得主要分子生物学治疗反应时BCR-ABL转录本绝对数量

实验室

标准化基线

Adelaide 80% 0.08%London 45% 0.045%Seattle 15% 0.015%MMR数值*29精品课件%无疾病进展0102030405060708090100随机分组后时间（月）03691215182124273033363942454851Imatinib一线治疗12个月分子生物学治疗反应与无进展生存p<0.001获得完全细胞遗传学治疗反应n=138下降<3对数级n=94下降>=3对数级n=13698%90%75%30精品课件QRT-PCR在AML中的应用诊断时转录本定量分析---确定融合基因亚型---有报道认为初始转录本定量对判断预后无价值---近期一组大型回顾性研究认为上述三种基因初始转录本数量与OS/EFS显著相关，但对CR率无影响，并对其进行危险程度分组。31精品课件CombinedprognosticimpactofexpressionlevelsatdiagnosisandMRDlevels.

themedianexpressionratioafterconsolidation

therapyandthe75thpercentileoftheexpressionratioatdiagnosis,

anewscorewasestablishedthatseparatesagroupwith100%

EFSfromasignificantlyworsegroup(P<.0001)ineach

ofthe3acutemyeloidleukemiasubgroups

.

SchnittgerS,etal.Blood2003;102:2746–55

32精品课件治疗缓解后MRD定量分析

---转录本下降程度与长期预后紧密相关，并可在某时间点确定一阈值将患者分为高危或低危复发组，但各组研究所得数据不尽相同

---分子学复发总是先于血液学复发

---增加随访次数如每3月一次，监测MRD波动水平来预测复发或许较某一时间点MRD水平更有价值

---在血液学复发前及时治疗干预是否可获得更佳治疗效果

*由于各组研究所选病例差异，AML亚型的不同，治疗方法不同，QRT-PCR试验材料不同等，其结果无可比性，还需更多的多中心前瞻性研究确定MRD定量监测与预后的关系，而PCR定量的标准化将是众多实验中心的努力目标33精品课件

KrauterJetal.

JClinOncol2003;21:4413–22

监测37例携带t(8;21)orinv(16)AML患者诊断及缓解后MRD，PCR定量融合基因转录本数，认为诱导后MRD至少下降2对数级是持续CR的前提条件，，复发患者中有7例诱导治疗后MRD有大幅度下降，但之后出现MRD水平升高。结论：PCR定量可作为判断预后危险程度分组依据之一缓解后任何时间点MRD转录本数与诊断时比值病例数n复发数nP<.001<1%262>/=1%111034精品课件SchnittgerS,etal.Blood2003;102:2746–55

CombinedprognosticimpactofexpressionlevelsatdiagnosisandMRDlevels.

themedianexpressionratioafterconsolidation

therapyandthe75thpercentileoftheexpressionratioatdiagnosis,

anewscorewasestablishedthatseparatesagroupwith100%

EFSfromasignificantlyworsegroup(P<.0001)ineach

ofthe3acutemyeloidleukemiasubgroups

.

35精品课件SchnittgerSBlood2003;102:2746–55

监测142例PML-RAR/AML1-ETO/CBFß-MYH11,认为诊断时高表达融合基因或经过巩固化疗后融合基因转录本下降小于3log的属于复发高危组，且MRD监测过程中出现转录本逐渐升高者预示即将复发。随访期监测MRD复发持续缓解持续升高80无明显升高趋势7127P<0.000136精品课件无特殊染色体或融合基因改变AML的MRD监测

一、免疫表型---流式细胞术FCM

白血病相关异常免疫表型LAIPleukemiaassociatedaberrantimmunophenotypes

白血病细胞始终存在异常畸变的表面抗原，多参数流式细胞术可将之与正常骨髓细胞区分开。诊断AML时将白血病细胞归为一组LAIP，并在之后各个时间点检测其在MRD表达率，以确定MRD数量。LAIP大致可分为四类：

1）非同步表达例CD15+CD33+CD34+;CD65+CD33+CD34+2）过表达CD34++HLA-DR++CD33++3）表达缺失CD33+CD34+HLA-DR-4）混合淋系表达CD33+CD34+CD2+5）分布异常Abnormallightscatterpattern

*但是仍有25%患者在诊断时无法归入任何一组LAIP,改进抗体制备技术及流式细胞仪的多信号分辨技术或许可解决这一问题。另外，少数患者复发时免疫表型发生改变也会影响其监测，有报道认为不使用诊断时所得LAIP，而在每一次测定时与正常骨髓细胞表型向比较更为恰当。37精品课件CD34PECD15FITCMRD(1)MRD(2)2mafterauto-SCT3mafterauto-SCT0.24%0.11%0.07%0%15+/34+/33+38精品课件CD34PECD15FITCMRD(1)MRD(3)0.11%3.2%0.24%7mafterauto-SCT15+/34+/33+39精品课件CD56PECD34FITCMRD(1)MRD(3)3mafterallo-SCT4mafterallo-SCT0.3%0.7%0.6%0%34+/56+/DR-40精品课件AML免疫表型分析对预后的意义FCM敏感度：0.1-0.01%,远高于细胞形态学的5%不断改进FCM技术，更好地区分出白血病细胞群和正常骨髓细胞群，有希望应用于所有AML患者的MRD检测，如四色荧光FCM，CD45设门技术的改进等某些时间点的MRD数量与EFS及OS相关诱导巩固治疗后较诊断时MRD下降的数量级与长期预后相关，或许可作为评判预后的独立因素FCM检测MRD定量分析可进行不同危险组分级但现有的报道仍不能为AML的预后分析提供完全的依据，尚还需大量临床研究41精品课件Relapseratesinthe4AMLriskcategoriesaccordingtonumberofLAPcellsinthefirstBMinMcr

Highrisk(MRD:greaterthan10-2LAPIcells);

intermediaterisk(MRD:10-3to10-2LAPIcells)

lowrisk(MRD:fewerthan10-3LAPI

cells);

verylowrisk(fewerthan10-4LAPIcells;nonehavehadrelapses).

.

BLOOD,15SEPTEMBER2001zVOLUME98,NUMBER6

42精品课件

Prognosticimpactoflogdifference(LD)afterconsolidationtherapy.PatientswithanLDhigherthanthe75thpercentile(2.94)(ie,astrongerreductioninleukemiccellmass)haveasignificantlybetterRFSandOS.

MultivariateanalysisidentifiedLDasanindependentprognosticfactorforRFSatbothcheckpoints.

WolfgangKernetalBLOOD,15NOVEMBER2004

VOLUME104,NUMBER10

43精品课件二、其他靶分子检测WT11992年Miwa等首先报道了70%～80%的急性白血病患者中WT1在白血病细胞中高表达，AML和CML-BP高于ALL，在正常成熟细胞中无表达或表达很低，两者表达水平相差一个以上的对数级。可用于几乎所有的白血病患者，其定量检测可以评价化疗或骨髓移植的疗效和确定白血病细胞的残留量，对早期预测复发及判定预后有重要的临床意义.但其敏感度较特殊融合基因低2个对数级，建议应用于无特异性标志的MRD检测。FLT3-LM研究证实其在20-25%的AML中可检出，在正常核型或其他核型aml中发生率约40%,而其突变率在AML中可达30%，FLT3出现或突变与高复发率相关，许多报道建议可作为MRD检测靶分子。但仍需更多研究提供有力证据。MLL-PTD,EVII基因的过表达也可作为检测MRD的靶分子，且均有报道支持其可行性，但仍需进一步研究。44精品课件

PereaGetal.Leukemia2005Nov10;[Epubaheadofprint]结论：可尝试联合使用FCM和QRT-PCR作预后分析MRD水平累计复发率P值FCM<0.1%67%<0.03>/=0.1%21%QRT-PCR<10-375%<0.04>/=10-321%45精品课件ALL儿童ALL前体B型可达98%CR，5年EFS将近80%，而今成人ALLCR率可达80%，但是5年EFS仅30-40%新的分子学缓解概念逐渐深入人心强调个体化治疗，根据不同危险因素对不同患者采取不同的治疗策略对现行危险程度分级标准仍有40%预后良好组会复发，而高危组则有20%不会复发46精品课件MRD监测在ALL中的应用MRD的研究或许可成为最有效可靠的预后评估指标MRD持续存在说明内源性耐药细胞的存在其测定可作为骨髓移植前净化的标准可根据MRD的情况进行危险程度分级和指导治疗现有的相关研究大部分为儿童ALL，成人只有少量报道47精品课件一、免疫表型---流式细胞术诊断时确定白血病细胞的抗原组合，称之为有效抗体组合或ALL-相关免疫表型，将之与正常骨髓细胞区分，用于定期监测MRDALL相关免疫表型

B-lineageCD19,CD34,Tdt,CD10,CD22,CD45,CD38

T-lineageTdT,CD2/cyt,CD3,CD5,CD7,etc.

根据技术要求可同时选用三种或以上抗体，一般选用一种高度敏感和一种高度特异性的表型组合，可覆盖约90%ALL患者，如CD19/CD38/CD34,Tdt/CD3/CD748精品课件

免疫表型---流式细胞术

对于儿童急淋，多个报道得出结论，20-40%患者在诱导治疗结束后或巩固治疗后MRD为阴性，其长期EFS可达90%较为一致的意见是10-4或以上MRD水平与复发危险度成正相关，但对于时间点确定看法不一St.Jude研究儿童高危组ALL，MRD水平有较大的异质性，认为诱导治疗后MRD大于10-2或巩固治疗后仍大于10-3者预后较差，复发率高，建议移植MRD的持续存在依然预示复发可能49精品课件Blood,15October2000,Vol.96,No.8,pp.2691-2696

PrognosticsignificanceofsequentialmeasurementsofMRDbyFCMinchildrenwithALL----mrd持续阳性者复发率高50精品课件Blood,15March2002,Vol.99,No.6,pp.1952-1958

ProbabilityofsustainedremissionaccordingtocombinedFCMRDresults,relativeandabsoluteestimate,fromweek12.

Byrelativeassessment,MRDvaluesofatleast0.1%leukemiccellsamongtotalBMNCsatleast0.01%wereclassifiedashighMRDByabsoluteestimation,atleast10

leukemiccells/µLBM1

blast/µLhighMRD.whoseleukemiccellswereclearedbelowtherelevantthresholdsbyweek12

(n

=

7and5,

respectively)weresubsumedintheMRDlow-loadgroups.Allthesepatientsstayedrelapse-freeexceptforonepatientoftherelative-estimateseries,who,incontrast,hadbeenassignedtotheMRDhigh-loadgroupatweek12

byabsolutecounting.51精品课件Blood,15June2003,Vol.101,No.12,pp.4695-4700

FCM测定102个成人ALL（大于14岁）MRD于d14\d35d35MRD情况d14MRD小于0.03%或阴性者5年RFS可达90%MRD定量病例数n中位RFS(m)低水平组<0.05%4342高水平组>/=0.05%4416P=0.00152精品课件二、特殊分子遗传学改变染色体异常及融合基因---FISH/PCR

B-lineage:T-lineageBCR-ABL---t(9;22)RHOM2-TCRgamma----t(11;14),MLL-AF4---t(4;11),HOX11-TCRalpha----t(10;14),TEL-AML1--t(12;21),TAL1deletionE2A-PBX1---t(1;19),MYC-IgH---t(8;14);TCR或IgH基因重排---PCR其重排均为克隆性，诊断时PCR分析Ig或TCR的基因构型，可追踪恶性克隆，以下为各基因重排发生频率WT1基因---PCR有报道认为不适合于ALL的预后分析

IgHTCRδTCRγTCRβB-ALL95%54%55%33%T-ALL14%68%91%89%53精品课件PCRforIgHgenerearrangementIgHgene(variable,diversity,andjoiningsegments)Uniqueclonalcomplementarity-determiningregion3(CDR3),detectedbyfingerprint,sensitivity1/103CDR3furtheranalyzedforDNAsequenceandallelespecificoligonucleotidewithsensitivity1/104

(MortuzaFetal,JClinOncol2002)54精品课件MRDdetectedbyIgHshowedsignificantcorrelationwithdiseasefreesurvivalOnly77%hadsuitablefingerprintingmarkerTediouswithneedforsequencinginsignificantnumberofpatients55精品课件ToubaiTetal.

AmJHematol.2005Nov;80(3):181-7.

测定共14例成人ALL患者骨髓细胞IgH、TCRδ、TCRγ重排，中位随访417天，其中IgH7