蛋白表达及纯化

关于蛋白表达及纯化Part1:蛋白表达、纯化第2页,共52页，星期六，2024年，5月蛋白表达流程目的基因cDNA表达宿主载体设计引物连接转化诱导表达蛋白纯化鉴定保存第3页,共52页，星期六，2024年，5月

gene第4页,共52页，星期六，2024年，5月Cell-freeBacterialYeastInsectMammalianHost第5页,共52页，星期六，2024年，5月ExpressionSystemCharacteristicsCharacteristicsE.coliYeastInsectMammaliandoublingtimerapid(30min)rapid(90min)slow(18-24hrs)slow(24hrs)costofgrowthmediumlowlowhighhighexpressionlevelhighlow–highlow–highlow–moderateproteinfoldingrefoldingmayberequiredrefoldingmayberequiredproperfoldingproperfoldingN-linkedglycos.nohighmannosesimple,nosialicacidcomplexO-linkedglycos.noyesyesyesphosphorylationnoyesyesyesacetylationnoyesyesyesacylationnoyesyesyesg-carboxylationnononoyesprojectcostlowlowmiddlehigh第6页,共52页，星期六，2024年，5月一：大肠杆菌表达外源基因的优势全基因组测序,共有4405个开放型阅读框架基因克隆表达系统成熟繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物大肠杆菌表达外源基因的劣势缺乏对真核生物蛋白质的复性功能缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白细胞周质内含有种类繁多的内毒素(endotoxin)第7页,共52页，星期六，2024年，5月Vector第8页,共52页，星期六，2024年，5月二大肠杆菌表达载体的基本组成一个良好的大肠杆菌表达载体：复制起点(ori)多克隆位点。筛选标记（抗菌素抗性基因、Tag、筛选标记）控制和调节转录与翻译的必不可少的原件外源基因在原核寄主细胞中表达,它的编码结构必须是连续的,不间断的,处于寄主启动子有效控制下。第9页,共52页，星期六，2024年，5月可使外源基因高水平表达的最佳启动子必须具备以下几个条件1)强启动子，外源基因的蛋白质的表达量占细胞总蛋白的10%-30%以上2)应能呈现出一种低限的基础转录水平3)应该是诱导型的,能通过简单的方式,使用廉价的诱导物得以诱导。常用的大肠杆菌表达载体启动子：

λ噬菌体的PL启动子大肠杆菌乳糖操纵子lac启动子色氨酸操纵子trp启动子

pBR322质粒的beta－内酰胺酶启动子启动子第10页,共52页，星期六，2024年，5月终止子a:如果在克隆基因编码区的3

末端之后，接上一个有效的转录终止子，便能够阻止转录通读过位于下游另一个启动子b:如果在启动子的上游部位放置一个有效的转录终止子,那么由该启动子驱动的克隆基因的转录便会被限制在最低本底水平。c:转录终止子还能增强mRNA分子的稳定性,大大提高蛋白质产物水平。d:在构建大肠杆菌表达载体时，通常是添加全部终止密码子,阻止核糖体跳跃(skipping)现象。e:大肠杆菌格外偏爱使用终止密码子UAA,当其后连上一个U而形成四联核苷酸的情况下,转译终止效率便会得到进一步加强第11页,共52页，星期六，2024年，5月转译起始序列a:mRNA的5

末端之独特的结构特征,是决定mRNA转译起始效率的主要因素。b:在构建外源基因的高效表达载体时,需认真选择有效的转录起始序列。c:未鉴定出通用有效的转译起始序列的保守结构(KOZAKSEQUENCE)第12页,共52页，星期六，2024年，5月筛选标记:其编码产物可被快速测定的功能单元。追踪某些特定的DNA结构(重组质粒)是否已经导入寄主细胞同任何一种目的启动子连接,其表达活性可作为检测启动子功能的依据。β－半乳糖苷酶基因lacZ荧光素酶基因(luciferase)基因、半乳糖激酶基因(galK)氯霉素抗性(乙酰转移酶)基因(cat)四环素抗性基因(tetr)Tag-第13页,共52页，星期六，2024年，5月第14页,共52页，星期六，2024年，5月目的基因保护碱基内切酶1内切酶2保护碱基第15页,共52页，星期六，2024年，5月Xgene引物的设计：设计一对特异性引物。上游、下游引物引入酶切位点oligo6RNA提取：TRNzol（附件）RT-PCR：附件1：DNAmarker；2：X基因扩增产物图1.1X基因的RT-PCR扩增产物第16页,共52页，星期六，2024年，5月GenecloningYourdestinationvectorR1R2YourlinearizedvectorX基因R1R2+1.双酶切目的基因和载体及切胶回收：附件目的基因保护碱基内切酶1内切酶2保护碱基2.连接转化：附件3.双酶切鉴定：附件4.测序：附件1：DNAmarker;2：重组质粒pET28-X双酶切;3：空质粒pET28a双酶切图1.3重组质粒pET28-X双酶切鉴定图1.4X基因发生点突变(AGU→AGC)，但为同义突变（Ser）第17页,共52页，星期六，2024年，5月Proteinexpression

检测该重组质粒在BL21中是否能被诱导表达，并确定在不同IPTG浓度和时间蛋白诱导效率的差异。挑单克隆菌落于7ml含有相应抗生素LB培养液的50ml培养管中，37C振荡培养过夜（8-16h）。37C，1mMIPTG终浓度诱导蛋白。取700ul过夜摇菌加入7ml含有相应抗生素LB培养液的50ml离心管中，于OD600＝0.4-0.6（1:100接种，37C培养时，细菌生长至OD600＝0.4-0.6约需2h）时加入终浓度为1mM的IPTG。诱导前在37C培养的菌液中取1ml未诱导的对照，按1ml菌液×OD600×100μl的比例(如1mlOD600为0.4的菌加40ulbuffer)加入2×上样缓冲液，混匀，-20℃保存或直接上样。根据蛋白分子量大小配置相应浓度的SDS胶。（50KD蛋白10％或12％）诱导3-4h后收集菌液，取1ml样品，测OD600，10000rpm，1min离心去上清后加入相应体积的2×上样缓冲液，vortex。将收集的菌液在水中煮5min，上样10μl，120V电压走浓缩胶，加电压至150V进入分离胶电泳，直到染料刚好走到胶底。取下胶，考马斯亮蓝染色至少30min（染液若是新配的，染20min就够了），脱色液脱色。若急需看到结果，可以将胶在500ml蒸馏水中煮沸两次即可看到条带。第18页,共52页，星期六，2024年，5月IPTGinductionEvenintheabsenceofIPTG,thereissomeexpressionofT7RNApolymerasefromthelacUV5promoter.Thedegreeoftoxicitywillvaryfromproteintoprotein.pETsystemmanual,Novagen,11thEdition第19页,共52页，星期六，2024年，5月1：蛋白marker；2~9：分别用IPTG诱导表达0、1、2、3、4、6、8、12h。图1.6X蛋白表达条件：诱导时间优化1：0mmol/L；2：0.25mmol/L；3：0.5mmol/L；4：0.75mmol/L；5：1.0mmol/L；6：1.5mmol/L；7：2.5mmol/L；8：3.5mmol/L；9：5.0mmol/L。图1.5X蛋白表达条件：IPTG浓度优化X蛋白在大肠杆菌中表达条件优化第20页,共52页，星期六，2024年，5月ProteinPurificationCharacterizefunction,activity,structureUseinassaysRaiseantibodiesmanyotherreasons...第21页,共52页，星期六，2024年，5月GuidelinesforproteinpurificationDefineobjectivesDefinepropertiesoftargetproteinandcriticalcontaminantsMinimizethenumberofstepsUseadifferenttechniqueateachstepDevelopanalyticalassaysAdaptedfrom:ProteinPurificationHandbook.AmershamBiosciences.18-1132-29,EditionAC第22页,共52页，星期六，2024年，5月BasicschemeofproteinpurificationFrom:ProteinPurificationHandbook.AmershamBiosciences.18-1132-29,EditionAC第23页,共52页，星期六，2024年，5月Proteinpreparation,extraction,clarificationCellgrowth,proteinover-expressionCelllysisRemovalofcelldebrisFrom:ProteinPurificationHandbook.AmershamBiosciences.18-1132-29,EditionAC第24页,共52页，星期六，2024年，5月Proteinisolation,concentration,andstabilizationReversibleprecipitationwithsaltororganicmoleculesFrom:ProteinPurificationHandbook.AmershamBiosciences.18-1132-29,EditionAC第25页,共52页，星期六，2024年，5月FractionalprecipitationofproteinsAddPrecipitant,CentrifugationChromatographyPrecipitatecontaminantsPrecipitateproteinofinterestDiscardsupernatant,ResuspendproteinDiscardpelletAddPrecipitant,Centrifugation,Discardsupernatant,Resuspendprotein第26页,共52页，星期六，2024年，5月IntermediatePurificationLiquidchromatography(lowerresolution,lowercost)From:ProteinPurificationHandbook.AmershamBiosciences.18-1132-29,EditionAC第27页,共52页，星期六，2024年，5月AnintroductiontoliquidchromatographyProteinsolutionappliedtoacolumnColumn=solidporousmatrix(stationaryphase)+liquid(mobilephase)ProteinsseparatedbasedondifferinginteractionswithstationaryandmobilephasesMobilephaseconditionscanbeadjustedtoincreaseordecreaseaffinityofproteinforstationaryphase(gradient)第28页,共52页，星期六，2024年，5月SizeexclusionchromatographyBiggerProteinsSmallerProteins第29页,共52页，星期六，2024年，5月AffinityChromatography第30页,共52页，星期六，2024年，5月AffinityChromatographyMostcommonly-usedchromatographytechniqueCanbeusedonproteinwithnaturalligandsOfteninvolvescovalentattachmentofaffinitytagtoproteinBecauseofuniquetag,providesrapid,specificcleanupinonechromatographystep*Canallowforautomationofproteinpurification第31页,共52页，星期六，2024年，5月PopularSmallAffinityTagsTagMatrixElutingAgentResiduesSequenceNotesHisNi2+-NTA,Talon,CobaltimidazoleorlowpH5-15HHHHHnativeordenaturing;inexpensiveresinFLAGanti-FLAGantibodylowpHorEDTA/EGTA8DYKDDDDKhighspecificity;harshelutioncond.StrepIImodifiedstreptavidindesthiobiotin8WSHPQFEKexpensiveresinS-peptideS-proteinenzymaticcleavage15KETAAAKFERHMDSdetectionpossible;expensiveresin第32页,共52页，星期六，2024年，5月PopularLargeAffinityTagsTagMatrixElutingAgentSizeNotesMBPamylosemaltose40kDasolubility+secretionenhancer;inexpensiveresinGSTglutathionereducedglutathione26kDainexpensiveresincellulose-bindingdomainscellulosewaterorGd•HCl4-20kDasecretionenhancercalmodulin-bindingpeptidecalmodulinEDTA/EGTA4kDadetectionpossible;expensiveresinHis-patchthioredoxinNi2+-NTA,Talonimidazole11.7kDasolubility+S-Senhancer第33页,共52页，星期六，2024年，5月镍柱亲和层析详细步骤：附件第34页,共52页，星期六，2024年，5月1：空质粒未诱导；2：空质粒IPTG诱导；3：细菌裂解液上清（可溶部分）；4：细菌裂解液沉淀（不可溶部分）；(B)切胶回收1：蛋白marker；2：重组质粒未诱导；3：重组质粒IPTG诱导；4：空白孔；5：纯化重组蛋白；

(C)Ni柱亲和层析：1-8为依次的蛋白过柱洗脱液图1.7X蛋白的可溶性分析(A)和纯化(B、C)蛋白纯化结果1.亲和层析柱2.切胶回收（附件）可溶性蛋白or包涵体纯化第35页,共52页，星期六，2024年，5月PolishingstepsFrom:ProteinPurificationHandbook.AmershamBiosciences.18-1132-29,EditionACLiquidchromatography(higherresolution,highercost)第36页,共52页，星期六，2024年，5月BasicschemeofproteinpurificationLiquidchromatography(higherresolution,highercost)Liquidchromatography(lowerresolution,lowercost)ReversibleprecipitationwithsaltororganicmoleculesCellgrowth,proteinover-expressionCelllysisRemovalofcelldebrisFrom:ProteinPurificationHandbook.AmershamBiosciences.18-1132-29,EditionAC第37页,共52页，星期六，2024年，5月TagRemovalNH2–proteintaglinkerDDDDKproteaseconsiderations:effectonstructureeffectonfunctionflexibilityprotein1°sequenceCurrentstrategiesfortheuseofaffinitytagsandtagremovalforthepurificationofrecombinantproteinsProteinExpressionandPurification

Volume48,Issue1,July2006,Pages1-13第38页,共52页，星期六，2024年，5月ProteindetectionmethodsSDSVisualconfirmationWesternblotUVSpectrophotometryAbsorbance@280nmDuemostlytoTrp[Protein]calculatedwithBeer’sLawColorimetricTechniquesColorchangeproportionalto[protein]Bradford,Lowry,BCAJ.S.C.OlsonandJohnMarkwell.

CurrentProtocolsinProteinScience(2007)3.4.1-3.4.291：未加IPTG诱导的重组质粒；2：IPTG诱导的重组质粒；3：空白孔；4：纯化后的重组蛋白图1.8重组蛋白的Westernblot分析26kDa1243Anti-6×Hisantibody第39页,共52页，星期六，2024年，5月FinalstepsinpurificationCheckpuritybydetectionmethodsConcentrateyourproteinPrecipitationCentriconsSmallcolumnwithhighbindingcapacityChooseastoragebufferandstorageconditionsConsiderintendeduseofproteinStabilizingadditivesFlashfreezeproteinandstoreat-80oCConfirmidentityofpurifiedproteinMassspectrometrysequencingAnalyticalassays第40页,共52页，星期六，2024年，5月Helpfulreferencesandguides附件：Protein_Expression_Protocol_3th.docpETsystemmanual,Novagen,11thEditionAmershamBiosciences“Proteinpurificationhandbook.”18-1132-29,EditionAC.GotofollowingURLanddownloadpdfofProteinPurificationHandbook:AffinityPurification:Arnau,J.,Lauritzen,C.,Petersen,G.E.,Pedersen,J.Prot.Expr.Purif.48(2006)1-13.J.S.C.OlsonandJohnMarkwell.CurrentProtocolsinProteinScience(2007)3.4.1-3.4.29第41页,共52页，星期六，2024年，5月Part2：抗体制备、应用

第42页,共52页，星期六，2024年，5月单抗制备多抗制备：附件抗体鉴定效价特异性第43页,共52页，星期六，2024年，5月PrincipleofMcAbProduction第44页,共52页，星期六，2024年，5月抗原经FCA或FIA充分乳化后免疫家兔。首次免疫佐剂用FCA，第二、三次用FIA。家兔脊柱两旁选5点皮下注射，每点注摄0.2ml，间隔后2周选不同点注射，每次免疫的抗原量约

350μg/兔。第三次免疫后10天，耳动脉取血检测抗体效价。双相琼脂扩散实验效价至少达到1:16；ELISA效价达到105即可放血。最后一次取血采用颈动脉放血。新西兰兔（附件）第45页,共52页，星期六，2024年，5月图1.9兔多克隆抗体效价测定-琼脂糖凝胶免疫扩散试验