非水相生物催化-(1)省公开课一等奖全国示范课微课金奖课件

第4章非水相生物催化第1页概述生产工艺优化是降低资源消耗和环境污染必定要求，即“化工过程生物化”或“化学-生物一体化”。生物催化系统主要由底物及产物、反应介质、生物催化剂三个基本要素组成。能够经过对基本要素改变到达优化反应目标。第2页非水相生物催化是将生物催化剂应用于非水介质来实现所期望化学反应或化学转化，这些技术和方法人们称之为非水相生物催化。早在1913年，Bousquelt等就发觉酶在有机溶剂（乙醇、丙酮等）中含有一定催化活性，但传统观念认为酶催化反应需要在水溶液中进行，只有在水溶液里酶才能维持其催化活性结构，有机溶剂将使酶变性失活或抑制其活性，所以这一发觉在当初并未受到应有重视。1966年，Dostoli和Siegel报道Chymotrypsin、Horseradishperoxidase在含有机溶剂介质中含有催化活性。1975～1983年，微生物细胞、游离酶和固定化酶在有机溶剂中合成酯、内固醇以及甾醇转化。第3页直到1984年，Klibanov等在《Science》上报道了脂肪酶在有机介质中不但含有较高催化活性，而且含有极高热稳定性，同时同种酶在不一样有机溶剂中能够表现出不一样立体选择性。之后，非水相生物催化研究才引发人们广泛关注和重视，相关研究报道日渐增多，并取得了突破性进展。开辟了非水相酶学（Non-aqueousenzymology)这一崭新研究领域，拓展了酶应用范围。年，Klibanov在《Nature》上综述了酶在有机溶剂中催化特征以及展望未来非水相生物催化发展趋势第4页酶活性和选择性实质上取决于酶空间结构，尤其是高级结构；而酶结构又取决于其分子内部以及它与周围环境之间各种作用力，如离子键、氢键等。改变酶一级结构是从根本上改变酶空间结构，而构象改变能够经过微环境调整来实现。介质多样化才能适应底物和催化剂多样化。水100%有机溶剂99.9%第5页非水介质酶催化研究内容基本理论研究，包含影响非水介质中酶催化主要原因以及非水介质中酶学性质经过非水介质中结构和功效研究，说明非水介质中酶催化机制，建立完善基本理论利用上述理论指导非水介质中酶催化反应应用

第6页酶非水相催化几个类型有机介质中酶催化有机介质中酶催化是指酶在含有一定量水有机溶剂中进行催化反应。适合用于底物、产物二者或其中之一为疏水性物质酶催化作用。酶在有机介质中因为能够基本保持其完整结构和活性中心空间构象，所以能够发挥其催化功效。气相介质中酶催化酶在气相介质中进行催化反应。适合用于底物是气体或者能够转化为气体物质酶催化反应。超临界介质中酶催化酶在超临界流体中进行催化反应。超临界流体是指温度和压力超出某物质超临界点流体。第7页有机相酶反应优点有利于疏水性底物反应可提升酶热稳定性能催化在水中不能进行反应可改变反应平衡移动方向可控制底物专一性可预防由水引发副反应可扩大反应pH值适应性酶易于实现固定化酶和产物易于回收可防止微生物污染第8页单一水或缓冲溶液系统有利于溶解和传质，各组分分布均匀。因为酶构象与其离子化状态亲密相关，所以酶体外试验研究通常在一定浓度缓冲溶液体系中进行，这么可确保酶在最正确pH附近发挥最大活力。缓冲溶液种类很多，在酶催化中使用最多可能是磷酸盐和Tris-HCl，因为大多数酶最正确pH在中性范围内(pH5~9)，但也有例外情况。第9页水-有机溶剂单相系统这种均一体系是由水和极性较大有机溶剂相互混溶组成反应体系。有机溶剂百分比对反应体系含有主要影响。酶和底物都是以溶解状态存在于均一体系中。不存在传质妨碍，但因为极性大有机溶剂对普通酶催化活性影响较大，所以能在该反应体系进行催化反应酶较少。假如该系统中有机溶剂百分比高过某一阈值，将夺去酶分子表面结构水，使酶失活第10页水-有机溶剂两相系统水-有机溶剂两相系统是指由水相和非极性有机溶剂相(烃、醚、酯等)组成非均相反应系统，体积比能够在很宽范围内变动。底物和产物则主要溶于有机相中；酶溶解于水相中，这么可使酶与有机溶剂在空间上相分离，以确保酶处于有利水环境中，而不直接与有机溶剂相接触。在两相系统中，分配系数(热力学参数)和质量传递系数(动力学参数)决定了酶反应拟一级速率常数kcat(=Vmax/KM)。所以整个反应速率主要由这两个原因(溶解度、搅拌速度等)所决定，而与酶催化能力关系不大。第11页值得注意是增加搅拌能够增加质量传递以提升酶催化反应速度，但不正确搅拌会产生机械和化学张力而造成酶失活。经过选择适当有机溶剂以及适度水相调整(如pH、盐浓度等)能够控制反应物在两相中分配。假如在均相系统中存在严重底物或产物抑制，那么使用两相系统可望在很大程度上缓解这一问题。第12页TopphaseBottomphase

SubstratesProductProduct

Sideproduct

BiocatalystAquousTwoPhaseSystem--ATPS构建两相体系实现在线产物分离第13页乳状液与微乳液系统在一些疏水性底物生物转化反应中，还经常使用表面活性剂稳定乳状液系统。比如，在脂肪酶催化拆分酮基布洛芬酯水解反应中，发觉添加适量非离子表面活性剂Tween-80，不但有利于难溶底物酯分散，使酶反应速度提升了13倍，而且酶反应对映选择性也大幅度提升，最多可提升两个数量级。类似地，在环氧水解酶催化反应中，也发觉添加乳化剂Tween-80要比添加助溶剂DMSO效果要好，不但改进了酶活性和选择性，而且提升了酶稳定性。第14页原理：形成反胶束系统，水分子聚集在反胶束内核中形成“微水池”，里面容纳了酶分子，这么酶被限制在含水微环境中，而底物和产物能够自由进出胶束。优点：①组成灵活性；②热力学稳定性和光学透明性；③逆胶束有非常高比界面积；④逆胶束相特征随温度而改变。第15页正胶束体胶束又称为正胶束或正胶团，是在大量水溶液中含有少许与水不相混溶有机溶剂，加入表面活性剂后形成水包油微小液滴。表面活性剂极性端朝外，非极性端朝内，有机溶剂包在液滴内部。反应时，酶在胶束外面水溶液中，疏水性底物或产物在胶束内部。反应在胶束两相界面中进行。第16页反胶束体系含有表面活性剂与少许水有机溶剂系统。反向微团：疏水尾部向外，与非极性有机溶剂接触；极性头部向内，形成一个极性核。反应时，酶分子在反胶束内部水溶液中，疏水性底物或产物在反胶束外部，催化反应在两相界面中进行。第17页雾点系统当一个非离子表面活性剂水相胶束溶液温度到达其雾点以上，或者在存在一些添加剂情况下，会造成相分离，形成一个表面活性剂稀少相(水包油乳液)和一个表面活性剂富集相(油包水乳液)，后者又称凝聚相，其中包含许多大水泡，可容纳细胞或溶解酶分子。这么系统被称为雾点系统(cloud-pointsystem)，它曾被用于分离技术中，即所谓雾点萃取。第18页微水有机溶剂单相系统均相有机溶剂体系是指用与水不互溶有机溶剂取代全部溶剂水(＞98%)，形成固相酶分散在有机溶剂中非均相反应体系。处于这种体系中酶，其表面必须有残余结构水，才能确保其催化活性。普通有机溶剂中含有小于2%微量水。惯用与水不互溶有机溶剂有烃类、醚、芳香族化合物、卤代烃等，它们疏水指数(logP)较大。固相酶在有机溶剂中含有催化活性是酶一项主要特征，在过去二十多年研究中，已证实这种体系是可行、可靠和多用途。第19页固相酶在结构上仍是柔性，酶分子内部柔性足以确保酶和底物结合时酶能产生微小构象改变，形成酶和底物结合中间复合体。酶分子比表面积约为(1～3)×106m2·kg－1，与活性炭相当；酶分子体积1/3～2/3是空，充满了溶剂；所以足够搅拌将确保底物能与酶表面或内部活性中心结合，并起催化反应。第20页就应用而言，显著降低反应混合物含水量是有利。因为酶在低含水系统中通常不溶，故得到是非均相反应混合物。酶既能够以游离酶粉(不论纯度怎样)形式直接使用，也可先固定在固相载体上再使用。但二者都必须使酶处于对催化最适合离子化状态，所以必须在将酶制备成粉末或固定化颗粒之前将溶液pH调整到最正确值。第21页超临界流体超临界流体概念指温度和压力均在本身临界点以上高密度流体，含有和液体一样凝聚力、溶解力；然而其扩散系数又靠近于气体，是通常液体近百倍。除了亲脂性有机溶剂外，超临界流体(supercriticalfluids)，如二氧化碳、氟里昂(CF3H)，烷烃类(甲烷、乙烯、丙烷)或无机化合物(SF6，N2O)等，都能够作为酶催化亲脂性底物溶剂，酶在这些溶剂中就像在亲脂性有机溶剂中一样稳定。第22页超临界流体对多数酶都能适用，酶催化酯化、转酯、醇解、水解、羟化和脱氢等反应都可在此体系中进行，但研究得最多是水解酶催化反应。这种溶剂体系最大优点是无毒、低粘度、产物易于分离。超临界流体粘度介于气体与液体之间，其扩散性比普通溶剂高1~2个数量级。超临界气体在临界点附近温度或压力有一点微小改变都会造成底物和产物溶解度极大改变，因而很轻易调控超临界流体中酶催化反应特征，如反应速率和选择性。该体系缺点是需要有能耐受几十个兆帕高压容器，而且减压时易于使酶失活。另外，有些超临界流体如二氧化碳可能会与酶分子表面活泼基团发生反应而引发酶活性丧失。第23页离子液体在最近10年中，离子液体(ionicliquids,ILs)作为一个新型反应介质，被用于各种类型反应，并经常产生显著效果，从而引发人们广泛注意。离子液体实质上是一些凝固点较低(m.p.<100oC)盐，比如1-烷基-3-甲基咪唑与PF6或BF4形成盐。离子液体作为一类极性溶剂，能溶解许多有机化合物。第24页与普通有机溶剂最大区分在于：①离子液体不会挥发(没有蒸气压)，对环境比较友好，用于工业生产也相对比较安全；②它们与许多有机溶剂互不相溶，能够形成有机溶剂-离子液体两相系统或者有机溶剂-水-离子液体三相系统，从而为溶剂工程在生物催化反应中应用提供了新可能。普通而言，离子液体通常有三种方式被应用于生物催化过程：①作为单一溶剂；②作为共溶剂添加于水相系统中；③与水形成两相系统。第25页无溶剂或少溶剂反应系统在许多情况下，反应系统最正确选择可能是根本不用溶剂，或者只用极少许溶剂。在最少有一个反应物为液体情况下，反应物之间质量传递能够经过流体相进行。第26页在无溶剂系统中适当提升反应温度，能够促进反应物分子扩散和混合，从而提升酶反应速度。当反应物均为固体颗粒时，也不一定非要用溶剂使其溶解。反应完全能够在含酶液相中进行，尽管该液相有可能完全隐藏在反应物固体颗粒之间缝隙中而看不见。为了形成这一隐形液相，普通只需加入极少许(比如反应物重量10%)某种“溶剂”，而最好溶剂可能就是水，因为水通常会使酶产生最高催化活力。第27页酶在有机介质中催化特征酶在有机介质中起催化作用时，因为有机溶剂极性与水有很大差异，对酶表面结构、活性中心结合部位和底物性质都会产生一定影响，从而显示出与水相介质中不一样催化特征.底物特异性；立体选择性；区域选择性；键选择性；热稳定性；活性；pH值第28页底物专一性在有机介质中，因为酶分子活性中心结合部位与底物之间结合状态发生一些改变，致使酶底物特异性会发生改变。有机介质使一些酶专一性发生改变，是酶活性中心构象刚性增强结果。酶促反应底物专一性本质是因为酶能够利用它与底物结合能和酶与水分子之间结合能差值。第29页从酶和底物间或键间自由能利用来分析：在水溶液中，酶活性中心极性基团和极性强底物分子之间形成强氢键，需要更多能量来破环它们之间氢键，以利于酶-底物络合物形成，造成对应反应速度降低（即酶与底物复合物结合能高，故在水溶液中倾向于选择极性低底物）；而在有机相中，因其不能形成氢键，酶对底物选择性朝相反方向进行。酶和底物之间结合能是酶催化反应主要推进力，底物必须从反应介质中解析出来与酶活性中心结合。很多酶活性中心都是疏水性，它们与疏水底物反应最有利，因为疏水性底物更轻易从水中解析抵达疏水性活性中心。然而以有机溶剂替换水后，疏水性底物与有机溶剂间相互作用增强，底物从溶剂抵达活性中心就比在水中困难，从而减慢了酶催化反应速度。而亲水性底物在疏水性较强溶剂中则轻易进入酶活性中心，从而加紧酶催化反应速度。第30页从热力学角度看，底物专一性改变原因是因为溶剂改变造成底物在有机溶剂与酶活性中心之间分配系数发生了改变。不一样有机溶剂含有不一样极性，所以在不一样有机介质中，酶底物专一性也不一样。第31页立体选择性酶对映体选择性（enantioselectivity）又称为立体选择性或立体异构专一性，是酶在对称外消旋化合物中识别一个异构体能力大小指标。酶立体选择性随溶剂疏水性增加而降低。酶在有机介质中催化，与在水溶液中催化比较，因为介质特征发生改变，而引发酶对映体选择性也发生改变。有机溶剂中酶对映选择性降低。第32页原因之一：是因为在水和有机溶剂中，底物两种对映体将水从酶分子疏水性结合位点上置换出来能力有所不一样。原因之二：在疏水性差溶剂里，疏水性基团进入酶疏水袋中比暴露在溶剂中热力学平衡更为有利，所以，酶分子中亲核基团易于进攻位置适当底物分子羟基，这么得到某个构型产物。而在疏水性强溶剂中，疏水性基团更倾向于暴露在溶剂中，而不易进入酶疏水袋，从而失去了酶对底物立体选择性。第33页化学键选择性酶在有机介质中进行催化另一个显著特点是含有化学键选择性。键选择性与酶起源和有机介质种类相关。（与氢键参数相关，易于形成氢键基团，不易进行反应；不易形成氢键基团易于反应。）第34页热稳定性许多酶在有机介质中热稳定性比在水溶液中热稳定性更加好。酶在有机介质中热稳定性还与介质中水含量相关。通常情况下，伴随介质中水含量增加，其热稳定性降低。在有机介质中，酶热稳定性之所以增强，可能是因为有机介质中缺乏引发酶分子变性失活水分子所致。第35页加热后酶活力改变第36页非水溶剂选择有机溶剂选择要适当，其主要是经过对体系中水、酶及底物和产物作用直接或间接地影响到酶活性。酶在低极性溶剂中含有较高活性和稳定性。有机溶剂极性强弱能够用疏水参数lgP表示。P是指溶剂在正辛烷与水两相中分配系数。疏水参数越大，表明其疏水性越强；反之疏水参数越小，则极性越强。第37页logP是衡量物质疏水性强弱一个特征参数,P=C正辛醇/C水第38页有机溶剂极性选择要适当，极性过强（lgP<2）溶剂，会夺取较多酶分子表面结合水，影响酶分子结构，并使疏水性底物溶解度降低，从而降低酶反应速度，在普通情况下不选取；极性过弱（lgP≥5）溶剂，即使对酶分子必需水夺取较少，疏水性底物在有机溶剂中溶解度也较高，不过底物难于进入酶分子必须水层，催化反应速度也不高。通常选取2≤lgP≤5溶剂作为催化反应介质。第39页第40页酶与水酶都溶于水，只有在一定量水存在条件下，酶分子才能进行催化反应。所以酶在有机介质中进行催化反应时，水是不可缺乏成份之一。有机介质中水含量多少对酶空间构象、酶催化活性、酶稳定性、酶催化反应速度等都有亲密关系，水还与酶催化作用底物和反应产物溶解度相关。第41页酶分子只有在空间构象完整状态下，才含有催化功效。在无水条件下，酶空间构象被破坏，酶将变性失活。故此，酶分子需要一层水化层，以维持其完整空间构象。维持酶分子完整空间构象所必需最低水量称为必需水（essentialwater）。第42页干燥酶水合过程：（1）与酶分子表面带电基团结合到达0-0.07g/g（水/酶）（2）与表面极性基团结合(0.07-0.25g/g)（3）凝聚到表面相互作用较弱部位（0.25~0.38g/g）（4）酶分子表面完全水化，被一层水分子覆盖。第43页酶活与水关系：酶活最大时——蛋白质结构动力学刚性和热力学稳定性（柔性）之间到达最正确平衡点。“刚柔并济”不一样酶需水量不一样同一个酶在不一样有机溶剂中需水量不一样，溶剂疏水性越强，需水量越少第44页胰脂肪酶活性与含水量关系：第45页热力学水活度指特定温度和压力条件下，反应体系中水摩尔分数Xw与水活度系数гw乘积：аw=гw*Xw水活度系数гw是溶剂疏水性函数，溶剂疏水性越大，гw越大。аw是在平衡状态时，反应体系中各组分（酶、溶剂、底物和产物）аw是相同。第46页第47页研究水活度意义：最正确水活度与溶剂极性几乎无关，大约在0.55左右能够排除溶剂对最适含水量影响水活度可由反应体系中水蒸汽压除以在相同条件下纯水蒸汽压而测得。第48页取得恒定水活度方法：用一个饱和盐水溶液分别预平衡底物溶液和酶制剂。向反应体系中直接加一个水合盐向每一溶剂中加入不一样量水第49页添加剂对非水相生物催化反应影响改变微环境条件；影响溶解和分散情况，降低传质阻力；也会增加反应体系复杂性。无机盐类添加剂；有机助溶剂；多醇类添加剂；表面活性剂。第50页有机溶剂中酶扩散与可取得性酶颗粒对底物含有扩散限制；相邻酶分子之间存在屏蔽现象。结构改变有机溶剂轻易使酶构象发生改变底物去溶剂化和过渡态稳定化能量学酶与底物结合过程所包括难易程度构象可塑性酶分子结构适当改变灵活性pH第51页pH记忆现象在水溶液中：pH决定酶离子化状态，从而影响酶构象，而酶构象又关系到酶活性和选择性；在有机溶剂中酶不能电离，所以必须进行预处理：将酶先溶解在少许最适pH值缓冲溶液中，然后沉淀或冻干。这么能够保持酶最正确电离状态，被称为“pH记忆”。从最适pH值水溶液中沉淀酶在有机溶剂介质中也表现出较高酶活性，有时可提升一个数量级。第52页离子强度影响伴随冻干时用缓冲溶液离子强度增大，酶活会增大。第53页第54页制订固定催化剂方法冻干粉末固定化酶在有机溶剂中直接沉淀増溶酶第55页非水相生物催化主要特点有利于许多新酶促反应发生无水环境下没有可造成酶失活共价反应，同时酶刚性增强。溶剂对酶选择性含有调控作用“分子记忆”、“印迹”现象、经过暂时增大底物分子体积增加酶对映选择性第56页酶非水相催化应用手性药品拆分生物能源手性高分子聚合物制备酚树脂合成导电有机聚合物合成食品添加剂生产甾体转化第57页酶催化反应应用脂肪酶肽合成青霉素G前体肽合成酯合成醇与有机酸合成酯类转酯各种酯类生产聚合二酯选择性聚合酰基化甘醇酰基化蛋白酶肽合成合成多肽酰基化糖类酰基化羟基化酶氧化甾体转化过氧化物酶聚合酚类、胺类化合物聚合多酚氧化酶氧化芳香化合物羟