高效液相色谱法-2016

第三章高效液相色谱法HighPerformanceLiquidChromatography(HPLC)一、高效液相色谱中的速率方程

迁移的流动相滞留的流动相涡流扩散项纵向扩散流动相传质滞留区传质固定相内传质结论:

提高柱效的关键是用小粒径填料：超高压液相UPLC

流动相粘度↓,n↑：高温液相色谱低流速，高柱效二、高效液相色谱仪1.仪器流程123123溶剂瓶溶剂瓶123234并联柱塞泵（左图）和串联柱塞泵（右图）1.单向阀；2.柱塞杆；3.泵腔；4.脉冲阻尼器高压泵六通进样阀2.检测器

紫外检测器（UVD）示差折光检测器（RID）荧光检测器（FD）蒸发光散射检测器（ELSD）电化学检测器固定波长可变波长二极管阵列(DAD)(1)紫外检测器A.固定波长的紫外检测器典型的流通池结构

B.可变波长的紫外检测器C.二极管阵列检测器3-DplotofDAD可得到每个峰的光谱图可进行谱库检索可进行纯度检验可进行多波长定量D.紫外检测器的特点选择性检测器高灵敏度线性宽稳定可做梯度HPLC的常规检测器通过选择合适的检测波长来提高方法的选择性(2)示差折光检测器A.结构通用灵敏度低温度敏感改变流动相要重新平衡体系不能做梯度B.示差折光检测器的特点(3)荧光检测器A.结构高选择性高灵敏度干扰少可做梯度激发波长和发射波长皆可变化B.特性(4)蒸发光散射检测器(ELSD)A.原理和结构I=a.mblgI=blgm+lga1-色谱柱；2-喷雾气体；3-蒸发漂移管；4-样品液滴；5-激光光源；6-光二极管检测器7-散射室

通用型灵敏度较高方便可梯度响应与质量有关B.ELSD的特性(5)电化学检测器Conductivitydetection:电导检测器DCAmperometricdetection:直流安培检测器Integratedandpulsedamperometric：积分或脉冲安培A.分类选择性检测器灵敏度高电导检测器是离子色谱的常规检测器DCamperometry:氰、硫离子和有机芳香胺、酚等Pulsedamperometry:糖类、氨基酸和脂肪胺类化合物及有机等硫化合物B.特点3.仪器附件Degas在线脱气机Gradient梯度洗脱装置ColumnThermostat柱温箱Autosampler自动进样器Fractioncollector馏分收集器梯度洗提梯度洗脱即程序控制流动相的组成，使在整个分离过程中，溶剂强度按照特定的变化规律增加。优点：分离复杂混合物，使所有组分都处在最佳的k值范围内。溶剂A溶剂B电磁阀A电磁阀B混合室泵溶剂A溶剂B高压泵A

高压泵B混合室低压溶剂梯度方框图高压溶剂梯度方框图实现方式对于复杂样品，线性梯度是最好的。正相色谱中，常用二氯甲烷加入到正己烷中来实现。反相色谱中，乙腈，甲醇加入到水中是最常用的。三、HPLC主要类型及其选择

化学键合相色谱法液固色谱法离子对色谱法离子色谱法体积排阻色谱法1.键合相色谱法（1）键合相色谱法的分类和分离机理正相色谱：流动相极性<固定相极性分配机理反相色谱：流动相极性>固定相极性疏溶剂（水）作用机理拓展知识：HILIC（亲水相互作用色谱）反相键合相色谱法的疏水机理：溶质进入极性流动相(水）后，其疏水基团由于水的斥力与非极性固定相上的烷基缔合，构成单分子吸附层。当流动相极性减小时，这种疏水斥力下降。类型分离方式应用特点C-18反相、离子对普适性好，保留值大。溶于水的高极性化合物、中等极性化合物C-8反相、离子对与C-18类似，保留值略小C-3,C-4反相保留值小，适合肽类和蛋白质苯基反相保留适中，选择性不同。非极性、中等极性化合物-CNHILIC、正相、选择性与硅胶类似，保留小，用途较广-NH2HILIC、正相分离糖类、核苷酸、固醇等二醇基HILIC、正相分离有机酸、排阻分蛋白质等醚基反相、正相分离酚类、芳硝基化合物，保留比C-18强聚苯乙烯基反相pH使用范围广，对部分分离峰形好，寿命长（2）常用固定相固定相的碳链长度对保留时间的影响固定相的商品牌号对分离的影响（3）流动相表征溶剂特性的重要参数溶剂强度ε°：溶剂分子与吸附剂的亲合程度溶解度参数δ：衡量溶剂极性强度的指标。是溶剂和溶质分子间色散力、偶极力、接受质子或给予质子能力的总和。δ相近的溶剂，选择性α不同。粘度η：溶剂的选择原则

具有稳定的化学性质；溶剂与检测器兼容粘度要小；沸点不太低；纯度高且价格便宜

正相：正己烷/正庚烷为主体，加入质子受体乙醚或甲基叔丁基醚，质子给体氯仿，偶极溶剂二氯甲烷等反相：以水为主体，加入质子受体甲醇，质子给体乙腈，偶剂溶剂四氢呋喃。

（4）影响保留值的因素溶质结构对保留值的影响：正相：溶质极性越强，官能团越多，保留值越大反相：溶质极性越弱，疏水性越强，保留值越大。溶质的保留值与其分子非极性部分的总面积有关，面积大，保留值大。烷基键合固定相特性对保留值的影响：反相：键合相烷链长，k大，选择性好溶剂性质：正相：溶剂极性越弱，保留越大反相：流动相表面张力大、介电常数大，则极性越强。其斥力越大，溶质与固定相键合越强，保留值越大。pH值的影响加入酸、碱或缓冲液，控制pH，抑制溶质的离子化，改善峰形。用于分析弱酸、碱。盐的影响：通常加入醋酸盐、硼酸盐、磷酸盐等。抑制溶质的离子化，改善峰型，抑制拖尾，提高保留时间的重复性。影响流动相的表面张力，所以对中性化合物的保留时间也略有影响。8种人参皂苷的k值与流动相离子浓度的关系应用2离子对色谱法

Ion-pairchromatography

（1）基本原理将一种或数种与样品离子电荷（A+）相反的离子(B-)（称为对离子或反离子）加入到色谱系统流动相中，使其与样品离子结合生成弱极性的离子对（中性缔合物）的分离方法。多为反相离子对色谱

（2）固定相、流动相和离子对试剂固定相：多为C18,C8反相键合相流动相：是以水为主的缓冲液，或水-甲醇、水-乙腈等混合溶剂离子对试剂：四丁基铵正离子、十六烷基三甲基铵正离子，ClO4-，十二烷基磺酸根等

（3）影响保留值的因素pH的影响：改善分离选择性的有效方法。反相中，对于阴离子的分离，pH下降，k减小。离子对试剂的性质与浓度：反相中，离子对试剂烷基链越长，疏水性越大，k越大。溶剂的极性：反相中，甲醇、乙腈等含量增加，洗脱强度增大，k下降。洗脱强度与极性参数、介电常数同时相关离子强度：反相中，离子强度增加，溶质k下降（4）应用

有机酸、有机碱特别是强酸、强碱的分析：如羧酸、磺酸、胺类、酚类、药物、染料等反相离子对色谱分析有机酸固定相：C18烷基键合相流动相：0.03mol/L四丁基铵+戊醇

1.4-氨基苯甲酸；2.3-氨基苯甲酸；3.4-羟基苯甲酸；4.3-羟基苯甲酸；5.苯磺酸；6.苯甲酸；7.甲苯-4-磺酸3.液固色谱法（1）分离机理以固体吸附剂为固定相的液相色谱法溶质分子和流动相分子在吸附剂表面的吸附活性中心上进行竞争吸附（2）固定相极性：硅胶、氧化镁、氧化铝等非极性：活性炭、高分子多孔微球、碳多孔微球等（3）流动相ε°越大，洗脱力越强。硅胶为固定相时：以正构烷烃为主体，加入二氯甲烷调节合适的洗脱强度。可用水对硅胶进行减活处理，或加入四氢呋喃、乙腈、甲醇、异丙醇等改性剂（4）影响保留值的因素样品分子结构溶质分子的官能团极性增加，保留值增加溶质分子的官能团数目增加，保留值增加保留值与溶质的空间效应有关保留值与吸附中心的几何分布有关吸附剂吸附剂的孔径越小，表面积越大，保留值越大吸附剂的活性越强，保留值越大流动相D.应用中等分子量的油溶性样品如油品、脂肪、芳烃等不同极性取代基的化合物结构异构体和几何异构体混合物的分离4.离子色谱法

(1)分离机理不同的离子与树脂离子的交换能力（亲和能力）不同，亲和力越大，离子越难洗脱，从而得以分离（2）离子色谱的仪器离子色谱的分离原理与离子交换色谱一样。最大的改进是解决了微量组分的检测问题。

双柱抑制型：在分离柱和检测器之间加一个化学抑制器，其作用有二，一是降低淋洗液的背景电导，二是增加被测离子的电导值，改善信噪比。灵敏度高。

单柱非抑制型：淋洗液直接进入电导检测器。简单、分辨率较好。无抑制器CounterIonsTimeTime有抑制器FSO42CI---FSO42CI---Y+Na+

X-:

样品中的阴离子Y+:

样品中的阳离子H2OH2OOH-Na+Y+H2ONa+Y+

X-

Na+CO32-(样品,淋洗液)H+H++CO32-H++X-

至检测器H2CO3H+X-H+

+O2H2OH2

+OH-H2ONa+OH-,H2H2O,O2废液废液电极（－）电极（＋）纯水或来自检测器的流体

H+H+H+H+阳离子交换膜阳离子交换膜抑制器的工作原理(阴离子)（2）固定相离子交换剂，根据功能基可分为：强酸型（磺酸基团）、强碱型（季铵基）、弱酸型（羧酸）、弱碱型（伯、仲、叔胺）等（3）流动相双柱抑制型：分离阳离子，一般采用无机酸如HCl，HNO3等；分离阴离子，一般采用NaOH、NaHCO3/NaCO3。单柱非抑制型：分离阳离子，用低浓度的HCl，HNO3等；分离阴离子，可用苯甲酸及其盐、酒石酸、柠檬酸等（4）影响保留值的因素溶质无机阴离子：与水合离子的半径有关，半径越大，保留值越大。还与离子的价态有关，价数越高，保留越强。有机阴离子：一元脂肪酸<一元芳香酸<二元脂肪酸<二元芳香酸，并于Pka有关阳离子：与价数及分子大小有关固定相：选择性的改变主要通过固定相来实现。选择性与固定相的组成（如交联度）、交换基团的结构、位置都有关。流动相的组成：组成不同，保留和选择性不同。流动相的浓度：浓度高，k下降，由于下降幅度与离子电荷数有关，因此用于改变一价离子和二价离子的选择性流动相的离子强度：离子强度增加，k下降流动相的pH：pH升高，阳离子交换色谱中，阳离子的保留值下降；因离子交换色谱中，阴离子保留值增加有机调节剂：如甲醇、丁醇、乙腈等。影响选择性。注意与柱的匹配。

（5）应用分析无机阴离子的首选方法还可用于分析无机阳离子，有机酸、碱，糖类、蛋白质等。多聚磷酸盐的分析Column: IonPac®AG14,AS14

Eluent: 3.5mMSodiumcarbonate

1mMSodiumbicarbonate

FlowRate: 1.2mL/min

Inj.Volume: 10

L

Detection: Suppressedconductivity,ASRS,

AutoSuppression®recyclemode

Peaks: 1. Fluoride 5 mg/L

2. Acetate 20

3. Chloride 10

4. Nitrite 15

5. Bromide 25

6. Nitrate 25

7. Phosphate 40

8. Sulfate 30010

SMinutes0246810121412345678常见阴离子分析5.体积排阻色谱法

（1）分离原理以多孔凝胶为固定相，利用精确控制的凝胶孔径，使样品中不同分子大小的组分得以分离。用于分子大小差大于10%的样品。VR=V0+KD·Vp0<KD<1.0洗脱体积在V0

和V0+Vp之间，峰容量有限，10-12个峰GFC(GelFiltrationChromatography)使用水溶液的凝胶过滤色谱法，用于分析多肽、蛋白质、核酸、多糖等。GPC(GelPermeationChromatography)使用有机溶剂的凝胶渗透色谱法，用于高聚物（如聚乙烯、聚氯乙烯等）分子量的测定。（2）固定相硬质凝胶高交联度苯乙烯、二乙烯苯共聚物：凝胶渗透色谱法多孔球形硅胶：凝胶过滤色谱法、凝胶渗透色谱法羟基化聚醚多孔微球：凝胶过滤色谱法特性参数：渗透极限，分离范围，固流相比（凝胶孔体积Vp/颗粒间体积Vo），柱效（3）流动相改善分离主要通过固定相来实现。流动相的选择原则是：能溶解样品与凝胶浸润与检测器匹配粘度小如四氢呋喃；缓冲溶液（4）应用（分子量的测定）（1）了解分析对象和分析要求6.液相色谱分离类型及条件选择Whatisthesample?Concentrationoftheinterestedcomponent（组分浓度？）Contaminant（干扰物？）Characteristicsoftheanalyte?Structure（结构）Molecularweight（分子量）pKa（酸碱性）Solubility（溶解度）（2）高效液相色谱分离类型及仪器条件采用何种高效液相色谱类型？对仪器有什么要求，类型？梯度？制备？采用何种检测器？采用什么色谱柱？（3）选择合适的分析条件流动相条件检测器的参数温度流速样品的前处理方