胰腺生物样本采集、处理和保藏技术规范

DB32/TXXXXX—XXXX胰腺生物样本采集、处理和保藏技术规范范围本文件规定了胰腺生物样本（血液、手术切除/穿刺获取胰腺组织、胰液、囊液等）的采集前准备、采集、处理、保藏和运输等全流程的技术规范。本文件适用于开展胰腺相关生物样本采集、处理、保藏和运输的生物样本库。规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T38576人类血液样本采集与处理GB/T38736人类生物样本保藏伦理要求GB/T37864生物样本库质量和能力通用要求WS/T225临床化学检验血液标本的收集与处理WS/T661静脉血液标本采集指南术语与定义下列术语和定义适用于本文件。胰腺生物样本pancreasbiospecimens为开展科学研究，从人体获得的胰腺相关组织、体液、细胞等生物材料，包括但不限于血液、胰液、胰腺组织、细胞等。临床研究骨干clinicalresearchfellow负责识别胰腺生物样本库收集对象、获取捐赠者知情同意、临床-实验室沟通的工作人员，应由相关临床科室的医师或护士担任。临床研究助理clinicalresearchassistant负责血样本的采集、运送，及时填写血样本流程单的工作人员，应由样本库技术员或相关临床科室的护士担任。生物样本库技术员biobanktechnician负责除血样本以外其他各类样本的采集，以及所有类型样本的处理、储存、出库，及时填写样本流程单的工作人员，可专职雇用，也可由经培训合格的医生或护士担任。以下简称技术员。标准分析前代码standardpreanalyticalcode根据国际生物和环境样本库协会发布的标准化样本分析前代码表，针对样本采集和实验分析之间的操作过程所形成的标准化代码。样本流程单sampleworkflowsheet记录样本采集、处理和储存过程中所有分析前代码（包括：时间、操作者、离心条件、储存位置等）的表单，按照采集的样本类型分为：血样本流程单、手术切除胰腺组织样本流程单、穿刺获取胰腺组织样本流程单和胰液样本流程单。样本库管理系统biobankmanagementsystem一套信息化软件系统，用来记录和追踪样本库内保存的每一份样本所处的位置与样本所关联的所有信息。套装kit将某个样本采集或处理流程中所需的耗材集中在一起，用塑封袋包装好，便于使用，按照功能不同进行分类。杜氏磷酸缓冲液dulbecco'sphosphatebufferedsaline，DPBS是用于短期维持哺乳动物细胞活性的一种平衡盐溶液，它可以在有限时间内维持离体细胞结构和生理学上的完整性。样本采集和保藏条件准备伦理审批人类生物样本保藏伦理方面应符合GB/T38736的要求。样本采集和保藏前相关方案和文件材料应经本单位或委托上级单位伦理委员会的批准同意后使用。此外，任何采集、保藏方案等文件的修改必须再次获得伦理委员会批准后实施，同时按照我国相关法规和伦理委员会要求及时递交其他跟踪审查文件。行政审批根据《中华人民共和国人类遗传资源管理条例》的要求，样本库对于采集和/或保藏的样本在获得伦理批件后应向国务院科学技术行政部门报批。人员配备样本库工作人员主要包括管理人员、临床研究骨干、临床研究助理、生物样本库技术员。样本库工作人员应具有临床医学、临床检验诊断学、护理学、生物学、病理学或管理学等相关专业背景。样本库工作人员应接受生物样本库的专业培训后上岗。样本库工作人员应与生物样本库签署保密协议。设备配备超低温冰箱：可提供长期稳定的-80℃样本保藏条件。台式离心机：离心过程中可保持离心室内温度为4℃，使用采血管离心时，可提供1300g的离心速度，使用微量离心管离心时，可提供16000g的离心速度。液氮罐：便携式液氮罐用于样本采集过程中的临时保藏和运输，大型液氮罐用于样本的长期保藏。知情同意获取临床研究骨干负责确定适合进行生物样本采集和保藏的病例，并通知技术员准备采集。临床研究骨干负责与样本捐赠者沟通，并获得捐赠者的书面知情同意。样本采集技术准备总则胰腺生物样本采集、处理和保藏应符合GB/T37864的要求。标签准备标签通过一套编号系统（唯一识别号）管理各样本，样本编号由样本库管理系统进行管理并自动分配（样本编号规则参见附录A）。低温环境下（-196℃/-80℃）保藏的物品应使用耐低温标签，以确保物品在低温条件下仍然具有唯一可识别性。标签内容技术员负责打印套装中各物品所对应的粘性标签，粘性标签上所打印内容应包括样本编号和样本类型全称，也可包括样本库管理系统根据编号自动生成的条形码或二维码（标签打印范例参见附录A）。特殊情况处理不适宜粘贴标签物品（例如石蜡标本盒）可使用手工标记。套装准备准备要求为方便管理及辨识内容物，宜使用同一类型但不同颜色标识的容器储存不同类型样本，并按照不同的生物样本采集或处理的标准作业流程，将各耗材归类形成相应套装。套装内所有物品均应当明确标记。将粘性标签粘贴于所对应各物品的合适位置，不适宜粘贴标签物品使用手工标记。将经标记的物品分别放入对应的套装袋中，同时在套装袋上贴标签标记。未使用但已贴标签的耗材可重复利用，使用前应确认物品完好无损，完整撕去标签或完全擦去手工标记后重复使用。套装分类套装按照不同的样本采集或处理流程的应用场景，分为如下：血样本采集套装、血样本处理套装、胰腺实性/囊性肿瘤收集套装、胰腺实性/囊性肿瘤穿刺样本收集套装、胰液样本收集套装（具体套装内容范例参见附录B）。套装使用详见本标准第6、7、8、9章节。血样本采集、处理和保藏血样本采集采集前应由临床研究助理确认知情同意书填写无误，并核对捐赠者身份信息（如：住院号、姓名等）与所使用血样本采集套装及物品编号匹配，然后应由临床护士负责抽血。采血管选择应满足后期科研用途，包括但不限于采用血清分离管、EDTA抗凝血浆分离管。抽血完成后，临床研究助理应尽快将知情同意书连同所采集血液样本一起送至生物样本库样本处理室交给技术员，宜保证血样本自采集至送达样本库的时间少于40分钟。技术员初步确认样本质量完好（如：采血管无破损、采血量足够、样本无溶血等）和知情同意书签署符合要求（签字完整、字迹清晰、填写位置准确等），否则拒绝接收样本。临床研究助理和技术员做好相关记录并签字确认。血样本的处理和保藏技术员使用准备好的血样本处理套装，按照WS/T225、WS/T661和GB/T38576的要求进行样本处理，分离获得血清/血浆/血细胞（血样本处理方法也可参照附录C）。技术员将各类血样本储存于超低温冰箱，应保证血样本自开始采集至存放入冰箱不超过2小时。技术员将样本基本信息、储存位置和标准分析前代码登记于各类文件和/或样本库管理系统中（信息登记详见附录D）。手术切除胰腺组织样本采集、处理和保藏样本采集前准备手术开始前，由技术员确认需要采集胰腺组织的病例，准备胰腺实性/囊性肿瘤收集套装，确认便携式液氮罐中有适量的液氮。样本采集过程中重要时间点记录技术员携带便携式液氮罐和套装前往手术室，等待手术标本离体，并在手术切除胰腺组织样本流程单上记录主要血管离断时间和标本离体时间（精确到分）。主要动脉血供离断时间和标本离体时间应由参与手术的临床研究骨干负责提供。各术式主要动脉血供离断时间计算方法如下：全胰切除术以胰十二指肠下后动脉、胃十二指肠动脉和脾动脉后离断者离断时间计；胰十二指肠切除术以胰十二指肠下后动脉和胃十二指肠动脉后离断者离断时间计；胰体尾切除术以脾动脉离断时间计；中段胰腺切除术、肿瘤剜除术中血管离断时间以标本离体时间计。胰腺实性肿瘤样本采集技术员按病理标准流程进行手术标本大体病理检视。技术员使用胰腺实性肿瘤收集套装，按照顺序取瘤旁组织和肿瘤组织，并分装，液氮保存组织大小宜为5mm×5mm×5mm，石蜡包埋组织大小宜为10mm×5mm×5mm。液氮保存瘤旁和肿瘤组织置入冻存管，确保旋紧密封盖后置入便携式液氮罐，待返回生物样本库后转移至长期储存液氮罐中。石蜡包埋瘤旁和肿瘤组织置于石蜡包埋盒内，完全浸泡于福尔马林中，固定24小时后制作石蜡包埋样本。技术员在手术切除胰腺组织样本流程单上记录参与手术的临床研究骨干、动脉血供离断时间和样本离体时间（精确到分）。确保组织自离体至置入液氮或福尔马林时间（冷缺血）少于20分钟。所有胰腺组织样本宜留有匹配的H-E染色切片，以备质量控制之用。技术员将样本基本信息、储存位置和标准分析前代码登记于各类文件和/或样本库管理系统中（信息登记详见附录D）。胰腺囊性肿瘤样本采集技术员按病理标准流程进行手术标本大体病理检视。技术员使用胰腺囊性肿瘤收集套装，先用注射器抽取>3mL囊液，按照1mL/管分装入冻存管中，置于冰上暂存。按照顺序取瘤旁组织和肿瘤组织，并分装，液氮保存组织大小宜为5mm×5mm×5mm，石蜡包埋组织大小宜为10mm×5mm×5mm。液氮保存瘤旁和肿瘤组织置入冻存管，确保旋紧密封盖后置入便携式液氮罐，待返回生物样本库后转移至长期储存液氮罐中。石蜡包埋瘤旁和肿瘤组织置于石蜡包埋盒内，完全浸泡于福尔马林中，固定24小时后制作石蜡包埋样本。临床研究骨干在手术切除胰腺组织样本流程单上记录参与手术的临床研究骨干、动脉血供离断时间和样本离体时间（精确到分）。确保组织自离体至置入液氮或福尔马林时间（冷缺血）少于20分钟，囊液样本自离体至置于冰上时间少于10分钟。所有胰腺组织样本宜留有匹配的H-E染色切片，以备质量控制之用。技术员将样本基本信息、储存位置和标准分析前代码登记于各类文件和/或样本库管理系统中（信息登记详见附录D）。囊液样本处理和保藏技术员在装有囊液的冻存管中加入100μL的DPBS，离心（建议离心条件：4℃，400g，5分钟）。将上清液转移至对应的冻存管中，将囊液上清和囊液细胞（下层沉淀）储存于超低温冰箱。技术员将样本基本信息、储存位置和标准分析前代码登记于各类文件和/或样本库管理系统中（信息登记详见附录D）。胰腺组织样本保藏方法低温保藏法可选用液氮直接保藏或组织保护液保藏。液氮直接保藏法：组织分装至冻存管后，立即将冻存管连同样本置于液氮（-196℃）中保藏。组织保护液保藏法：组织分装至预先盛有组织保护液的冻存管内，组织保护液与样本的体积比应至少为10:1，以保证样本全部浸入保护液，最终将冻存管连同浸于保护液的样本置于液氮中保藏。其他处理细节按不同保护液各异，具体参照保护液说明书。石蜡保藏法福尔马林固定应超过24小时，制作蜡块并放置于蜡块柜内，并在样本库管理系统登记；由病理科医生对石蜡保存样本H-E染色切片进行评估，内容包括：肿瘤细胞、癌前病变、坏死组织、纤维化、炎细胞浸润和正常胰腺组织的比例；技术员在病理评估单上进行相应信息登记。信息登记完成上述保藏程序后，技术员将样本基本信息、储存位置和标准分析前代码登记于各类文件和/或样本库管理系统中（信息登记详见附录D）。穿刺获取胰腺组织样本采集、处理和保藏样本采集前准备穿刺开始前，由技术员确认需要采集胰腺组织的病例，准备胰腺实性/囊性肿瘤穿刺样本收集套装，确认便携式液氮罐中有适量的液氮。技术员携带便携式液氮罐和套装前往内镜室，提前交由临床研究骨干。胰腺实性肿瘤穿刺样本采集由参与内镜操作的临床研究骨干进行穿刺组织大体病理检视，确认穿刺物主要为实质性肿瘤成分。临床研究骨干使用胰腺实性肿瘤穿刺套装，按照顺序分别将瘤旁组织和肿瘤组织分别置入冻存管和石蜡包埋盒中。确保旋紧密封盖后将冻存管置入便携式液氮罐,石蜡包埋盒完全浸泡于福尔马林中。临床研究骨干在穿刺获得胰腺组织样本流程单上记录穿刺者和样本离体时间（精确到分）。确保组织自离体至置入液氮或福尔马林时间（冷缺血）少于10分钟。所有胰腺组织样本宜留有匹配的H-E染色切片，以备质量控制之用。穿刺完成后，临床研究骨干负责将液氮罐、所收集样本和流程单一起送至生物样本库处理室交给技术员，技术员初步确认样本收集和流程单填写符合要求。技术员将冻存管转移至长期储存液氮罐中，福尔马林固定样本在固定24小时候制作石蜡包埋样本。由技术员完成样本基本信息、储存位置和标准分析前代码在各类文件和/或样本库管理系统信息登记（信息登记详见附录D）。胰腺囊性肿瘤穿刺样本采集当确认穿刺进入囊腔后，由参与内镜操作的临床研究骨干抽取>3mL囊液，按照1mL/管分装入冻存管中，置于冰上暂存。临床研究骨干在在穿刺获得胰腺组织样本流程单上记录穿刺者和样本离体时间（精确到分）。应确保囊液样本自离体至置于冰上时间少于10分钟。技术员将样本基本信息、储存位置和标准分析前代码登记于各类文件和/或样本库管理系统中（信息登记详见附录D）。囊液样本处理和保藏处理和保藏方法同7.5。穿刺获取胰腺组织样本保藏方法保藏方法同7.6。胰液样本采集、处理和保藏胰液样本获取方式胰液样本收集可通过术中胰管穿刺抽吸（切断胰管前穿刺）、内镜穿刺/引流、外伤病人外引流等途径获得。胰液样本采集技术员应确认采集的胰液是新鲜获得，并准备胰液样本收集套装。按照1mL/管分装入冻存管中，置于冰上暂存。技术员在胰液样本流程单上记录采集者和样本离体时间（精确到分）。应确保胰液样本自离体至置于冰上时间少于10分钟。技术员将样本基本信息、储存位置和标准分析前代码登记于各类文件和/或样本库管理系统中（信息登记详见附录D）。胰液样本处理和保藏处理和保藏方法同7.5。样本保藏条件保藏环境专用场地：生物样本库应明确规定其活动所需要的场地及环境要求，宜设置专用场地。场地划分：场地应明确划分为“核心工作区”、“缓冲区”和“辅助工作区”。温湿度要求：生物样本库储存空间，尤其是有多台产热设备（如：超低温冰箱）的房间，应配置环境温湿度控制设备，室内温度应控制在16℃~22℃，湿度应控制在30%~60%。供电保障：生物样本库应配备双电路供电系统和/或备用不间断供电电源。环境消毒：分为操作台消毒、地面消毒、空气消毒三类，应分别应用75%乙醇擦拭台面、1000mg/L有效氯消毒液拖地、紫外灯照射等方式进行处理。氧含量检测及通风：应在液氮罐储存区域内安装气体监测装置（如O2监测器）和排气系统。储存环境包含但不仅限于以上内容，详情请参考ISBER2018样本库最佳实践（第四版）。安全监控消防安全：生物样本库应配备消防给水系统和无水阻燃剂灭火器，并定期进行消防设施检修和维护。冷链系统：超低温冰箱应配备冷链系统，设置每隔一段时间监测冰箱内温度，在出现超出设定温度范围时能够及时发出警报，按照既定程序，通知工作人员采取合理的处理措施。液氮剩余量监测：宜使用能够自动检测液氮剩余量并填充液氮的液氮罐，或由工作人员应定期测量液氮的液面高度，或在液氮罐的不同高度放置探测器来测量液氮高度。数据安全：所有涉及患者个人信息的数据（包括纸质、电子数据）均应储存在安全的环境中，并与外界有三道安全措施（例如：物理锁、指纹锁或者电子密码等）。生物样本库的所有数据应定期备份于物理地址隔绝的另一个完全的环境中。应急预案：生物样本库应具备完善的应急预案来应对各种紧急事故（包括但不限于火灾、水灾、生物安全灾害、人员触电/缺氧急救等），并对该预案进行定期测试。医疗废物处理：按照医疗场所医疗废物处理的一般原则进行。样本出库和运输样本出库申请提出和批准：首先应由申请者提交样本使用申请及研究计划伦理审批书，经样本库主管审核通过、样本库主任签字批准同意方可进行样本的出库。研究者应持经审核通过的申请单至生物样本库，交给技术员进行样本查询，打印预出库样本详单。样本取出：由技术员按照预出库样本详单取出样本，预先准备干冰或液氮以尽可能降低操作过程中样本周围环境温度，过程中尽量缩短操作时间并减少样本反复冻融。确认样本出库：样本取出后，技术员应核对信息无误，确认出库，并生成样本出库单，最终由样本库主管签字确认后，完成出库。样本运输运输温度应根据样本类型不同，选择不同的运输保温措施，根据样本运输的预计时间准备保温材料，充分保证运输过程中的温度控制符合要求（具体参见附录E）。体液样本运输主要包括血样本、囊液、胰液为主的体液样本（具体运输流程参见附录E）。胰腺组织样本运输主要包括手术或穿刺获得的胰腺组织样本（具体运输流程参见附录E）。

（资料性附录）

生物样本库标签打印规则生物样本库低温标签打印模板见图A.1生物样本库标签打印模板库类型简写年份年内编号样本类型分装号自动生成二维码样本类型（全称）

（资料性附录）

胰腺生物样本库套装分类范例胰腺生物样本库套装分类及明细内容建议见表B.1胰腺生物样本库套装分类及明细内容范例套装名称主要耗材流程单标签血样本采集套装EDTA抗凝血浆分离管×1、血清分离管×1血样本流程单所有物品对应标签血样本处理套装冻存管（红色盖）×4、冻存管（白色盖）×4、微量离心管×4/所有物品对应标签胰腺实性肿瘤收集套装冻存管（蓝色盖）×3、冻存管（白色盖）×3、石蜡包埋盒×2手术切除胰腺组织样本流程单所有物品对应标签胰腺囊性肿瘤收集套装冻存管（蓝色盖）×3、冻存管（白色盖）×3、冻存管（黄色盖）×3、微量离心管×3、石蜡包埋盒×2手术切除胰腺组织样本流程单所有物品对应标签胰腺实性肿瘤穿刺样本收集套装冻存管（蓝色盖）×1、石蜡包埋盒×1穿刺获取胰腺组织样本流程单所有物品对应标签胰腺囊性肿瘤穿刺样本收集套装冻存管（黄色盖）×3、微量离心管×3穿刺获取胰腺组织样本流程单所有物品对应标签胰液样本收集套装冻存管（黄色盖）×3、微量离心管×3胰液样本流程单所有物品对应标签

（资料性附录）

血样本处理方法血浆、血细胞样本处理若样本收集目的无需单独分离外周血白细胞和/或血小板，技术员可将抗凝血按照1ml/管分装入微量离心管后离心（建议离心条件：室温，16000g，1分钟），离心后吸取上清血浆至对应冻存管，微量离心管内剩余的有形成分即为血细胞。若样本收集需单独分离外周血白细胞和/或血小板，则按照试剂盒说明书的要求分离白膜层，所获得白膜层成分可继续用于外周血单个核细胞等细胞成分的分离。各类血样本宜储存于超低温冰箱，应保证血样本自采集至入库不超过2小时。由技术员完成样本基本信息、储存位置和分析前变量在各类文件和/或样本库管理系统信息登记。血清样本处理技术员确认干燥血清管已静置30分钟。将干燥血清管离心（建议离心条件：室温，1300g，10分钟），分装上清血清至对应冻存管。各类血样本宜储存于超低温冰箱，应保证血样本自采集至入库不超过2小时。由技术员完成样本基本信息、储存位置和标准分析前代码在各类文件和/或样本库管理系统信息登记。

（资料性附录）

信息登记胰腺生物样本基本信息登记内容见表D.1胰腺生物样本基本信息登记捐赠者基本信息血样本采集、处理和保藏流程信息组织样本采集、处理和保藏流程信息胰液/囊液采集、处理和保藏流程信息标本号采集日期和时间采集日期和时间采集日期和时间住院号采血护士姓名临床研究骨干姓名采集后是否放在冰上暂存性别送达生物样本库日期和时间主要动脉血供离断时间胰液/囊液样本处理条件（包括：样本预处理方式、离心机型号、离心具体条件）出生日期临床研究助理姓名组织离体时间病理诊断签收技术员姓名组织样本置入液氮和福尔马林固定时间知情同意获得与否离心日期和时间血样本处理条件（包括：样本预处理方式、离心机型号、离心具体条件）分装量是否达标入库具体位置（包括：冰箱号、架子号、层号、盒子号、位置号）入库日期与时间操作技术员姓名

（资料性附录）

样本运输运输温度不同样本类型，选择不同的运输保温措施：冷藏样本（2-8℃）：应装入冰块或凝胶袋（-15℃冷藏温度或用相变物质用于冷冻运输）；冷冻样本（-20℃）：应使用为冷冻设计的凝胶袋，保持样本温度于-20℃或-20℃以下；冷冻样本（-80℃）：应使用干冰颗粒、干冰块、干冰片。干冰冷冻剂被认作危险运输物品，应贴上危险物品的标识符；冷冻样本（≤-150℃）：应使用干燥液氮罐运输。将样本置于充有足够量液氮的非密封容器内，液氮被认为是一种危险系数较低的物品，也无需受制于国际航运协会危险物品的管制条约。体液样本运输各类型样本运输流程如下：新鲜血样本：常温运输，保证运输过程平稳，切勿剧烈震荡，常温运输，保证采血到运送至生物样本库不超过40分钟；新鲜囊液、胰液样本：应准备盛满碎冰的保温转运盒，将装有样本的容器置于冰上运送至样本库；冻存血、囊液、胰液样本：应准备装满干冰的泡沫箱，冻存管包埋入干冰中，宜用胶带封好泡沫箱，尽快运送至目的地（干冰应当准备充分，确保运输全程的温度控制）。组织样本运输手术或内镜下穿刺获得的组织样本运输流程如下：新鲜组织：应准备盛满碎冰的保温转运盒、装有生理盐水的密封容器，获得组织样本后，将其放入装有预冷生理盐水的密封容器中，并置于保温转运盒中，运输至回实验室进行后续操作；低温冻存组织：应准备装满干冰的泡沫箱或是盛有足够液氮的隔热容器，冻存管包埋入干冰或浸于液氮中，泡沫箱或隔热容器不应完全密封，尽快运送至目的地（干冰准备应当充分，确保运输全程的温度控制）；石蜡包埋组织和切片：石蜡包块和石蜡切片可放在隔热装置中常温运输，同时防止其处于超过27℃的环境。参 考 文 献[1]CampbellLD,AstrinJJ,DeSouzaY,Giri,J,PatelAA,Rawley-PayneM,RushAandSieffertN.

The2018RevisionoftheISBERBestPractices:SummaryofChangesandtheEditorialTeam'sDevelopmentProcess.BiopreservationandBiobanking.16(1):3-6.[2]中国医药生物技术协会生物样本库标准（试行）.中国医药生物技术，2011;6(1):71-79.[3]ElliottP,PeakmanTC;UKBiobank.TheUKBiobanksamplehandlingandstorageprotocolforthecollection,processingandarchivingofhumanbloodandurine.IntJEpidemiol,2008;37(2):234-244.[4]TuckMK,ChanDW,ChiaD,etal.Standardoperatingproceduresforserumandplasmacollection:earlydetectionresearchnetworkconsensusstatementstandardoperatingprocedureintegrationworkinggroup.JProteomeRes,2009;8(1):113-117.[5]NCIBestPracticesforBiospecimenResources,Institute,N.C.,2011;1–81./bestpractices/2016-NCIBestPractices.pdf[accessedMarch2016][6]LehmannS,G