食品安全作业

食品中沙门氏菌检验GB4789.4-2010食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验检验仪器和材料1冰箱：0℃～4℃。2恒温培养箱：36℃±1℃，42℃。3显微镜：10×～100×。4高压灭菌器。5超净工作台。6均质器或灭菌乳钵。7架盘药物天平：0g～500g,精确度0.5g。8灭菌广口瓶：500mL。9灭菌锥形瓶：500mL、250mL。10灭菌吸管：10mL（具0.1mL刻度）。11天菌培养皿：90mm。12灭菌小试管：内径3mm×50mm。13灭菌毛细管。检验使用的培养基和试剂1缓冲蛋白胨水(BP)2氯化镁孔雀绿(MM)增菌液3四硫酸钠煌绿(TTB)增菌液4亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液5亚硫酸铋琼脂(BS)6DHL琼脂7HE琼脂：按GB/T4789.28—2003中4.21规定。8TSI琼脂9蛋白胨水、靛基质试剂10尿素琼脂(pH7.2)11氨基酸脱羧酶试验培养基12沙门氏菌因子血清：按26种用于初步分型；57种用于进一步分型；163种用于详细分型。检验沙门氏菌的样品1鲜猪肉、鲜牛肉；冻猪肉2鲜牛奶、鲜鱼；冻鱼3香肠、虾仁沙门氏菌检验具体流程

检样

前增菌法

直接增菌法

冻肉、蛋品、乳品及其它加工食品

鲜肉、鲜蛋、鲜乳及其它未经加工的食品

25g＋BP225mL

25g＋灭菌生理盐水25mL制成检样均质液（36±1）℃一般4h，干蛋品18～24h10mL＋MM(或TTB)100mL

10mL＋SC100mL

检样均质液的半量＋MM(或TTB)100mL

检样均质液的半量＋SC100mL42℃18～24h（36±1）℃18～24h42℃18～24h（36±1）℃18～24h

BS

DHL(或HE、WS、SS)（36±1）℃40～48h（36±1）℃18～24h

挑取可疑菌落

TSI（斜面、底层、产气、H2S）、蛋白胨水（靛基质）、尿素（pH7.2）、KCN、赖氨酸

H2S＋靛基质－

H2S＋靛基质＋

H2S－靛基质－

非如左述的

尿素－KCN－赖氨酸＋

尿素－KCN－赖氨酸＋

尿素－KCN－赖氨酸＋/－

各种反应结果

甘露醇、山梨醇

ONPG

沙门氏菌血清学实验

沙门氏菌血清学实验

非沙门氏菌

非沙门氏菌

报告检验沙门氏菌操作步骤1、前增菌和增菌冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品均应经过前增菌。以无菌操作取25g（mL），加在装有225mL缓冲蛋白胨水的500mL广口瓶内。固体食品可先应用均质器以8000～10000r/min打碎1min，或用乳钵加灭菌砂磨碎，粉状食品用灭菌匙或玻棒研磨使乳化，于36℃±1℃培养4h(干蛋品培养18h～24h)，移取10mL，转种于100mL氯化镁孔雀绿增菌液或四硫酸钠煌绿增菌液内，于42℃培养18h～24h。同时，另取10mL，转种于100mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液内，于36℃±1℃培养18h～24h。鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品不必经过前增菌。各取25g(25mL)加入灭菌生理盐水25mL，按前法做成检样匀液；取25mL，接种于100mL氯化镁孔雀绿增菌液或四硫磺酸钠煌绿增菌液内，于42℃培养24h；另取25mL接种于100mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液内，于36℃±1℃培养18h～24h。2、分离取增菌液1环，划线接种于一个亚硫酸铋琼脂平板和一个DHL琼脂平板(或HE琼脂平板、WS或SS琼脂平板)。两种增菌液可同时划线接种在同一个平板上。于36℃±1℃分别培养18h～24h(DHL、HE、WS、SS)或40h～48h(BS)，观察各个平板上生长的菌落。3、生化试验自选择性琼脂平板上直接挑取数个可疑菌落，分别接种三糖铁琼脂、蛋白陈水(供做靛基质试验)、尿素琼脂(pH7.2)、氰化钾(KCN)培养基和赖氨酸脱竣酶试验培养基及对照培养基各1管，于36℃±1℃培养18h～24h，必要时可延长至48h，按生化反应初步鉴定表判定结果。按反应序号分类，沙门氏菌属的结果应属于A1、A2和B1，其他5种反应结果均可以排除。沙门氏菌属各群在各种选择性琼脂平板上的菌落特征选择性琼脂平板沙门氏菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ沙门氏菌Ⅲ（即亚利桑那菌）BS琼脂产硫化氢菌落为黑色带有金属光泽，棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株不产生硫化氢，形成灰绿色的菌落，周围培养基不变黑色带有金属光泽DHL琼脂无色半透明，产硫化氢菌落中心带黑色或几乎全黑色乳糖迟缓阳性或阴性的菌株与亚属Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ相同；乳糖阳性的菌株为粉红色，中心带黑色HE琼脂WS琼脂蓝绿色或蓝色；多数菌株产硫化氢，菌落中心黑色或几乎全黑色乳糖阳性的菌株为黄色，中心黑色或几乎全黑色；乳糖迟缓阳性或阴性的菌株为蓝绿色或蓝色，中心黑色或几乎全黑色SS琼脂无色半透明，产硫化氢菌株，有的菌落中心带黑色，但不如以上培养基明显乳糖迟缓阳性或阴性的菌株与亚属Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ相同；乳糖阳性的菌株为粉红色，中心黑色，但中心无黑色形成时与大肠埃希氏菌不能区别肠杆菌科各属在三糖铁琼脂内的反应结果斜面底层产气硫化氢可能的菌属和种－＋＋/－＋沙门氏菌属、弗劳地氏柠檬酸杆菌、变形杆菌属、缓慢爱德华氏菌＋＋＋/－＋沙门氏菌Ⅲ、弗劳地氏柠檬酸杆菌、普通变形杆菌－＋＋－沙门氏菌属、大肠埃希氏菌、蜂窝哈夫尼亚菌、摩根氏菌，普罗菲登斯菌属－＋－－伤寒沙门氏菌，鸡沙门氏菌、志贺氏菌属、大肠埃希氏菌、蜂窝哈夫尼亚菌、摩根氏菌，普罗菲登斯菌属＋＋＋/－－大肠埃希氏菌、肠杆菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、弗劳地氏柠檬酸杆菌注：＋阳性；－阴性；＋/－多数阳性，少数阴性肠杆菌科各属生化反应初步鉴别表反应序号硫化氢（H2S）靛基质pH7.2尿素氰化钾（KCN）赖氨酸脱羧酶判定结果A1＋－－－＋沙门氏菌属A2＋＋－－＋沙门氏菌属（少见）缓慢爱、德华氏菌A3＋－＋＋－弗劳地氏柠檬酸杆菌、奇异、变形杆菌A4＋＋＋＋－普通变形杆菌B1－－－－－－－－＋－沙门氏菌属、大肠埃希氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌大肠埃希氏菌、志贺氏菌属B2－－＋＋－－－＋－大肠埃希氏菌、大肠埃希氏菌、志贺氏菌属B3－－－－＋/－＋＋＋＋－克雷伯氏菌族各属阴沟肠杆菌、弗劳地氏柠檬酸杆菌B4－＋＋/－＋－摩根氏菌，普罗菲登斯菌属注1：三糖铁琼脂底层均产酸，不产气者可排除；斜面产酸与产气与否均不限。注2：KCN和赖氨酸可选作其中一项，但不能判定结果时，仍需补做另一项。注3：＋表示阳性；－表示阴性；＋/－表示多数阳性，少数阴性。沙门氏菌检验——几点注意冷冻样品解冻需在45℃以下，有自动调温器自控的水浴锅内不断搅拌进行15min或在2-8℃，18小时内软化。为保证检验的准确性，必须在选择性培养基上挑取足够数量的菌落进行生化和血清学鉴定。进行生化反应时，应以纯培养物进行试验，如出现血清学阳性，而生化反应特征不符合时，应对接种物进行纯化，用纯化后的培养物重新进行生化试验。测试中应同时接种阳性对照菌株。食品中金黄色葡萄球菌的检测1、增菌培养法1.1检样处理：无菌操作取样25g（mL）加入225mL灭菌生理盐水，固体样品研磨或均质制成混悬液。1.2增菌及分离培养：吸取5mL上述混悬液，接种于7.5%氯化钠肉汤或胰酪胨大豆肉汤50mL培养基内，36℃±1℃培养24h，转种血平板和BP平板，36℃±1℃培养24h，挑取血平板上金黄色（有时为白色）菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶实验。2.1梯度稀释转种BP平板吸取上述1：10混悬液，进行10倍第次稀释，根据样品污染情况，选择不同浓度的稀释液1mL，分别加入三块BP平板，每个平板接种量分别为0.3mL、0.3mL、0.4mL，然后用灭菌涂布器涂布整个平板，如水分多不易吸收，可将平板放在36℃±1℃1h，等水分蒸发后反转平皿置36℃±1℃培养。2、直接计数方法2.2转种血平板在三个平板上寻找周围有浑浊带的黑色菌落，并从中任选五个菌落，分别接种血平板，于36℃±1℃培养24h后进行染色镜检、血浆凝固酶试验，步骤同增菌培养方法。2.3菌落计数将三个平板中疑似金黄色葡萄球菌黑色菌落数相加，乘以血浆凝固酶阳性数，除以5，再乘以稀释倍数，即可求出每克样品中金黄色葡萄球菌数。流程三法特点及适用性：第一法适用于食品中金黄色葡萄球菌的定性检验第二法适用于金黄色葡萄球菌含量较高的食品中金黄色葡萄球菌的计数第三法适用于金黄色葡萄球菌含量较低而杂菌含量较高的食品中金黄色葡萄球菌的计数。GB4789.10-2010食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验GB4789.10-2010第一法金