T-SHFCA 002-2024 特殊医学用途配方食品中维生素A、D、E的测定在线固相萃取-二维液相色谱法

ICS67.050CCSX80DeterminationofvitaminA,D,EinfoodsforspecialmedicalpurposesbyOn-linesolidphaseextraction-two-dimensionalliquidphaseIT/SHFCA002—2024前言 2规范性引用文件 3术语和定义 4原理 5试剂与材料 6设备和仪器 37分析步骤 38分析结果表述 59精密度 510检出限和定量限 5附录A（资料性）维生素A、D、E标准溶液浓度校正方法 6附录B（资料性）仪器连接示意图和维生素A、D、E标准溶液液相色谱图 7T/SHFCA002—2024本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由江苏省疾病预防控制中心提出。本文件由江苏省保健食品化妆品安全协会归口。本文件起草单位：江苏省疾病预防控制中心、泰州市食品检验院、贵州省检测技术研究应用中心（贵州省分析测试研究院）、黑龙江飞鹤乳业有限公司、江苏省食品药品监督检验研究院、武汉食品化妆品检验所、中国检验检疫科学研究院综合检测中心、内蒙古智慧质量中心、南京威尔药业科技有限公司、南京苏勤邦企业管理咨询有限公司、南京玉鹤鸣医学营养科技股份有限公司、鲲鱼健康药业江苏有限公司、郑州瑞普生物工程有限公司、南通励成生物工程有限公司、西安力邦临床营养股份有限公司。本文件主要起草人：韦娟、胡慧、吴新文、王象欣、薛瑾、卢跃鹏、叶颖慧、仪虹伯、吴淏迪、蒋欢、余文兵、李燕、任艳艳、施佰惠、杨宏、朱铭洪、朱峰、张昊、凌映茹、孙晨、王溪、杨润、曹子健、吉文亮、贾静。本文件为首次发布。1T/SHFCA002—2024特殊医学用途配方食品中维生素A、D、E的测定在线固相萃取-二维液相色谱法本文件规定了特殊医学用途配方食品中维生素A、D、E的在线固相萃取-二维液相色谱测定方法。本文件适用于特殊医学用途配方食品中维生素A、D、E的测定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4原理样品经皂化（含淀粉样品需先用淀粉酶酶解）后，皂化液经离心、过滤后进二维液相色谱系统，样品经过一维色谱柱进入接口中，通过浓缩、捕集、切割后进入二维色谱中；一维液相色谱分析维生素A和维生素E4种生育酚异构体，二维液相色谱分析维生素D，采用外标法定量。5试剂与材料除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。5.1试剂5.1.1无水乙醇（C2H6O）：色谱纯。5.1.2乙醇（C2H6O）。5.1.3乙腈（C2H3N）：色谱纯。5.1.4甲醇（CH4O）：色谱纯。5.1.5抗坏血酸（C6H8O6）。5.1.62，6-二叔丁基对甲基苯酚（C15H24O）：简称BHT。5.1.7磷酸（H3PO4）：色谱纯。5.1.8氢氧化钾（KOH）。5.1.9甲基叔丁基醚（C5H12O）：简称MTBE，色谱纯。5.1.10淀粉酶：活力单位≥100U/mg。5.2试剂配制5.2.150%乙醇水溶液：量取500mL乙醇与500mL水，混合均匀，储存于具塞锥形瓶中。5.2.2氢氧化钾溶液（50g/100g）：称取50g氢氧化钾，加入50mL水溶解，冷却后储存于聚乙烯2T/SHFCA002—2024瓶中。5.2.30.1%磷酸水溶液：移取1mL磷酸，用水稀释至1000mL。5.3标准品5.3.1维生素A视黄醇（C20H30O，CAS号：68-26-8纯度≥95%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。5.3.2维生素E5.3.2.1α-生育酚（C29H50O2，CAS号：10191-41-0纯度≥95%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。5.3.2.2β-生育酚（C28H48O2，CAS号：148-03-8纯度≥95%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。5.3.2.3γ-生育酚（C28H48O2，CAS号：54-28-4）：纯度≥95%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。5.3.2.4δ-生育酚（C27H46O2，CAS号：119-13-1纯度≥95%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。5.3.3维生素D5.3.3.1维生素D2：钙化醇（C28H44O，CAS号：50-14-6），纯度>98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。5.3.3.2维生素D3：胆钙化醇（C27H44O，CAS号：67-97-0纯度>98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。5.4标准溶液配制5.4.1维生素A标准储备溶液（0.500mg/mL）准确称取25.0mg维生素A标准品(5.3.1)，用无水乙醇（5.1.1）溶解后，转移至50mL棕色容量瓶中，用无水乙醇（5.1.1）定容至刻度，此溶液浓度为0.500mg/mL。将标准储备溶液转移至棕色储液瓶中，在-18°C下避光保存，有效期1个月。临用前将溶液回温至室温，并进行浓度校正（校正方法见附录A）。5.4.2维生素E标准储备溶液（1.00mg/mL）分别准确称取α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚标准品(5.3.2)50.0mg，用无水乙醇（5.1.1）溶解后，转移至50mL棕色容量瓶中，用无水乙醇（5.1.1）定容至刻度，此溶液浓度为1.00mg/mL。将各标准储备溶液转移至棕色储液瓶中，在-18°C下避光保存，有效期6个月。临用前将溶液回温至室温，并进行浓度校正（校正方法见附录A）。5.4.3维生素D标准储备溶液(100μg/mL)准确称取维生素D2标准品(5.3.3)10.0mg，用无水乙醇（5.1.1）溶解后，转移至100mL棕色容量瓶中，用无水乙醇（5.1.1）定容至刻度，得到维生素D2标准储备液（浓度100μg/mL）。准确称取维生素D3标准品(5.3.3)10.0mg，用无水乙醇（5.1.1）溶解后，转移至100mL棕色容量瓶中，用无水乙醇（5.1.1）定容至刻度，得到维生素D3标准储备液（浓度100μg/mL）。将各标准储备溶液转移至棕色储液瓶中，在-18°C下避光保存，有效期3个月。临用前将溶液回温至室温，并进行浓度校正（校正方法见附录A）。5.4.4维生素A、D、E混合标准溶液分别准确移取维生素A标准储备液0.2mL、α-生育酚标准储备液2.0mL、β-生育酚标准储备液2.0mL、δ-生育酚标准储备液2.0mL、γ-生育酚标准储备液2.0mL、维生素D2标准储备液0.1mL、维生素D3标准 储备液0.1mL于100mL容量瓶中，用50%乙醇水溶液（5.2.1）定容至刻度，得到维生素A、D、E混合标准溶液（维生素A：1μg/mL，维生素E：20μg/mL，维生素D：0.1μg/mL）。临用现配。3T/SHFCA002—20245.4.5维生素A、D、E混合工作液分别移取适量维生素A、D、E混合标准溶液，用50%乙醇水溶液（5.2.1）稀释成以下浓度：维生素5.0ng/mL，10ng/mL，20ng/mL，50ng/mL，100ng/mL）4.0μg/mL，10μg/mL，20μg/mL）。6设备和仪器6.1在线固相萃取-二维液相色谱系统：含有三个独立输液泵、一个自动进样器、一个柱温箱、两个紫外检测器（或者二极管阵列检测器）。6.2分析天平：感量0.01g和0.0001g。6.3高速离心机：转速不低于10000r/min。6.4微孔滤膜：有机系，孔径0.22μm。6.5涡旋混合器。6.6紫外分光光度计。6.7恒温振荡器。7分析步骤7.1试样制备将一定数量的样品按要求经过缩分、粉碎、均质后，储存于样品瓶中，避光冷藏，当天测定。7.2试样处理警示：使用的所有器皿不得含有氧化性物质；处理过程应避免紫外光照,尽可能避光操作；提取过程应在通风柜中操作。7.2.1不含淀粉样品称取2g~5g（精确至0.01g）经均质处理的固体试样或10g~50g（精确至0.01g）液体试样于250mL具塞锥形瓶中，固体试样另需加入约20mL温水（40℃~45℃),混匀，再加入1.0g抗坏血酸（5.1.5）和0.1gBHT（5.1.6），混匀，加入30mL乙醇（5.1.2），加入10mL~20mL氢氧化钾溶液（5.2.2），边加边摇匀，混匀后于80℃±2℃恒温振荡皂化30min，皂化后立即用冷水冷却至室温，皂化液转移至100mL棕色容量瓶中，加50%乙醇水溶液（5.2.1）定容至刻度，混匀，移取10mL皂化液于15mL离心管中，10000r/min离心5min，上清液过0.22μm微孔滤膜后供液相色谱测定。7.2.2含淀粉样品称取2g~5g（精确至0.01g）经均质处理的固体试样或10g~50g（精确至0.01g）液体试样于250mL具塞锥形瓶中，固体试样另需加入约20mL温水（40℃~45℃),混匀，加入0.5g~1g淀粉酶（5.1.10于60℃±2℃恒温避光振荡30min后，再向酶解液中加入1.0g抗坏血酸（5.1.5）和0.1gBHT（5.1.6），恒温振荡皂化30min，皂化后立即用冷水冷却至室温，皂化液转移至100mL棕色容量瓶中，加50%乙醇水溶液（5.2.1）定容至刻度，混匀，移取10mL皂化液于15mL离心管中，10000r/min离心5min，上清液过0.22μm微孔滤膜后供液相色谱测定。7.3仪器参考条件7.3.1流路连接（见附录B图1）7.3.2色谱参考条件4T/SHFCA002—20247.3.2.1在线固相萃取柱（SPE）：PLRP-S，4.6×12.5mm，15-20μm，或相当者。7.3.2.2一维分析柱：Poroshell120PFP，4.6×100mm，4µm，或相当者。7.3.2.3捕获柱：Poroshell120EC-C18，4.6×5mm，4µm，或相当者。7.3.2.4二维分析柱：ZorbaxEclipsePlusPAH，2.1×100mm，3.5µm，或相当者。7.3.2.5柱温：35°C。7.3.2.6SPE泵流动相、流速及参考洗脱梯度表见表1。7.3.2.7一维流动相、流速及参考洗脱梯度表见表2。7.3.2.8二维流动相、流速及参考洗脱梯度表见表3。7.3.2.9阀位置：阀1：0min（位置1-6）；4.5min（位置1-2）；5.9min（位置1-6）；阀2：0min（位置1-6）；19.1min（位置1-2）；19.8min（位置1-6）。阀2具体时间阀切以系统实验维生素D出峰时间为准。7.3.2.10进样量：100μL。7.3.2.11检测波长：一维：0~18.5min：325nm；18.5~20.5min：264nm（根据维生素D保留时间调整）；20.5~30.0min：294nm。二维：264nm。表1SPE泵流动相、流速及参考洗脱梯度表%%%%0000000000000000000000000000表2一维液相色谱流动相、流速及参考洗脱梯度表%%00表3二维液相色谱流动相、流速及参考洗脱梯度表%%005T/SHFCA002—2024%%007.3.3维生素D切割窗口的确定按7.3.2色谱条件，此时阀2不切换：0~30min（位置1-6）。按顺序分别进1针空白溶液和2针维生素液相色谱图见附录B图2所示。7.3.4维生素A、D、E完整分析方法的建立根据附录B图2结果确定维生素D捕获窗口并编辑阀2的切换时间。切换开始时间为维生素D色谱峰起始时间减去0.1min，切换结束时间为维生素D色谱峰回到基线时间加0.1min。其余条件与6.3.2色谱条件一样，得到完整的维生素A、D、E分析方法。8分析结果表述式中：X——试样中维生素A或维生素D或维生素E的含量，维生素A、维生素D单位为微克每百克(μg/100g），维生素E单位为毫克每百克(mg/100g)；c——根据标准曲线计算得到的试样中维生素A、维生素D、维生素E的浓度，单位为微克每毫升(μg/mL）；V——定容体积，单位为毫升(mL)；f——换算因子（维生素A、维生素D：f=1；维生素E：f=0.001）；100——由每克换算为每百克的换算系数。计算结果保留三位有效数字。如维生素E的测定结果要用α-生育酚当量(α-TE）表示，可按下式计算：维生素E（mgα-TE／100g）=α-生育酚（mg/100g）+β-生育酚（mg/100g）×0.5+γ-生育酚（mg/100g）×0.1+δ-生育酚（mg/100g）×0.01；试样中同时含有维生素D2和维生素D3，维生素D的测定结果以维生素D2和维生素D3的含量之和计算。9精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。10检出限和定量限当取样量为5g，定容体积为100mL时，维生素A的检出限为9μg/100g，定量限为24μg/100g；维生素D的检出限为1.92μg/100g，定量限为4.8μg/100g；各生育酚的检出限为0.24mg/100g，定量限为0.60mg/100g。6T