酿酒酵母中提高乙醇产量的工程拓扑结构和蔗糖代谢动力学的研究

1介绍酿酒酵母主要以两种方式代谢蔗糖。在第一个也是占主导地位代谢中，蔗糖被SUC2基因编码胞外转化酶水解,水解产生葡萄糖和果糖经过由HXT基因家族组员编码己糖转运子帮助扩散进入细胞。在第二种代谢中，蔗糖经过质子同向运输机制进入细胞并在胞内水解。胞内和胞外转化酶都是由同一基因（SUC2）编码。

1、研究从胞外空间到胞内蔗糖水解重新定位能否用于提升蔗糖乙醇产量；2、对于只能利用胞内转化酶菌株，是否有其它步骤提升其蔗糖利用率。酿酒酵母中提高乙醇产量的工程拓扑结构和蔗糖代谢动力学的研究第1页2材料与方法2.1酵母菌株及保养用于该研究酿酒酵母菌株是CEN.PK族同源体系。2.2菌株构建参考菌株CEN.PK113-7D(SUC2)改良iSUC2菌株IMI056、IMM007、IMM008、IMM009。酿酒酵母中提高乙醇产量的工程拓扑结构和蔗糖代谢动力学的研究第2页2.3培养基和培养预培养：含有100ml合成培养基500ml摇瓶置于200rpm

Innova震荡培养箱中培养。50%蔗糖溶液在转移到培养基之前经过过滤灭菌。厌氧培养培养基需添加溶于乙醇麦角甾醇（10mg/l）和吐温80（420mg/l）。在800rpm、30℃2L试验室生物反应器中进行厌氧恒化发酵。有效容积用电子传感器和废水泵保持在1.0L。pH经过自动添加2MKOH保持在5.0。培养过程中以500ml/min喷入氮气（<10ppm氧气）。在生物反应器中，使用氯化橡胶管子和氟橡胶O型圈，培养器皿用氮气冲洗。酿酒酵母中提高乙醇产量的工程拓扑结构和蔗糖代谢动力学的研究第3页2.4分析方法将液体培养基离心处理后取得上清液、残留糖分上清液和培养基经过HPLC分析，HPLC用是60℃、5mMH2SO4作为流动相，流速为0.6ml/minAminexHPX-87H离子交换柱。乙醇、甘油、琥珀酸盐和乳酸盐由Waters2410相差检测仪检测。丙酮酸和醋酸盐是由Waters2487紫外检测仪214nm处检测得到蒸发得到乙醇浓缩物。酿酒酵母中提高乙醇产量的工程拓扑结构和蔗糖代谢动力学的研究第4页2.5转化酶试验在恒化器中选出细胞，冲洗两次，在冷水中重新悬浮。胞外转化酶活性由葡萄糖发酵测得。在30℃、含有150mM蔗糖、50mM氟化钠50mMTris-丁二酸缓冲(pH5.0)中进行细胞孵育。为测转化酶总活力，细胞用乙醇、10%TritonX-100和甲苯(1:4:1)渗透，冲洗两次，并在30℃、含100mM蔗糖50mMTris-丁二酸缓冲(pH5.0)中孵育。全部试验一式三份，确保标准误差<10%酿酒酵母中提高乙醇产量的工程拓扑结构和蔗糖代谢动力学的研究第5页2.6蔗糖质子转运试验蔗糖吸收中质子转运取决于酵母悬浮液中对pH改变统计。酵母细胞悬浮在细胞浓度为25g/lK-邻苯二甲酸酯缓冲液（pH5.0）中，并存放在总体积为5ml水夹套容器中。悬浮物在30℃下由磁力搅拌器混合。蔗糖引发pH改变由pH传感器监控。为了计算质子吸收率，用100-500nmolNaOH细胞悬浮液做一标准曲线。蔗糖引发最初质子吸收率由蔗糖添加后第一个10-20s斜率减去蔗糖添加前质子吸收率。全部试验一式三份，确保标准误差<15%。酿酒酵母中提高乙醇产量的工程拓扑结构和蔗糖代谢动力学的研究第6页2.7微列阵处理和分析DNA芯片分析采取S98酵母基因芯片阵列法，细胞直接从恒化器中转移到液氮中，经过15ug完整RNA与一个环cDNA综合体试剂盒组成成份就能合成一个双股cDNA综合体。在试管转录之前利用基因芯片样品清理模块纯化双链cDNA，并标明是基因芯片IVT标识试剂盒。最终，在15ug生物酰化cRNA分裂和杂交之前用基因芯片样品净化模块纯化标识cRNA。阵列图像和过滤数据采集和定量是由Affymetrix基因芯片操作系统软件（1.2版）来完成。添加在MicrosoftExce中微阵列显着性分析（SAM）2.23A版本用于比较在蔗糖限制条件下IMI056和IMM007复制阵列试验。酿酒酵母中提高乙醇产量的工程拓扑结构和蔗糖代谢动力学的研究第7页3.1蔗糖代谢拓扑学：影响生物量和乙醇产量理论分析只采取胞内水解路径菌株乙醇产量增加与采取胞外路径菌株产量有以下关系（1）YSucE，intra=0.75YSucE，extra+0.25YSucE，max（2）R=0.75+1/YSucE，extra其中R=YSucE，intra/YSucE，extra在参考菌株CEN.PK113-7D厌氧蔗糖限制性恒化培养中，蔗糖乙醇产量为2.96mol/mol。假设该菌株胞内蔗糖水解作用可忽略，则乙醇产量与YSucE，extra一致。这表明胞内水解作用转变可使乙醇产量提升8.7%。酿酒酵母中提高乙醇产量的工程拓扑结构和蔗糖代谢动力学的研究第8页3.2SUC2基因工程引发胞液中转化酶重定位在工程菌株‘iSUC2’IMI056和参考菌株CEN.PK113-7D(SUC2)中转化酶定位是经过比较总和胞外蔗糖水解活性来分析。在对照菌株中90%总转化酶活性来自于胞外，在iSUC2中94%转化酶活性来自于胞内（表3）。iSUC2菌株总转化酶活性比对照菌株高，可能是因为表示iSUC2基因ADH1开启子应用。在iSUC2菌株IMI056中发觉在胞外有低转化酶活性（表3），可能是因为一些胞内转化酶释放或是其它未知低活性胞外蔗糖水解酶。酿酒酵母中提高乙醇产量的工程拓扑结构和蔗糖代谢动力学的研究第9页6%90%蔗糖跨膜转运最适动力学妨碍蔗糖胞内水解代谢一些胞内转化酶释放或是其它未知低活性胞外蔗糖水解酶

酿酒酵母中提高乙醇产量的工程拓扑结构和蔗糖代谢动力学的研究第10页3.3转化酶胞质表示对生长化学计量学轻微影响iSUC2菌株生物产量只比SUC2对照菌株低6±2%（表3）。这个差异远小于胞内蔗糖完全水解​​时预测25%差异。与两种菌株生物产量微小差异相一致，工程菌乙醇产量只有一个微小增加（表3）。工程菌IMI056(1.8g/l)恒化培养中蔗糖残余浓度比对照菌株CEN.PK113-7D(<0.1g/l)要高很多。这表明蔗糖跨膜转运最适动力学阻止了高效蔗糖胞内水解代谢。酿酒酵母中提高乙醇产量的工程拓扑结构和蔗糖代谢动力学的研究第11页3.4提升蔗糖转运量和乙醇产量恒化培养试验室进展提升一个数量级从2g/l降低到大约0.1g/l酿酒酵母中提高乙醇产量的工程拓扑结构和蔗糖代谢动力学的研究第12页3.5AGT1对提升改良iSUC2菌株蔗糖转运动力学上主要作用为研究AGT1在提升蔗糖质子转运动力学方面所设计原因，改良iSUC2菌株IMM007中敲出AGT1。转运体在改良菌株中仍表现出二分之一蔗糖质子转运量，该转运体正确整合了AGT1基因转座子。染色体DNA诊疗PCR扩增显示出改良iSUC2菌株中全部AGT1重复片段，去除改良iSUC2菌株中全部AGT1重复片段时，它蔗糖质子转运能力快速下降。酿酒酵母中提高乙醇产量的工程拓扑结构和蔗糖代谢动力学的研究第13页在胞内蔗糖水解作用和有效地蔗糖发酵中Agt1p蔗糖转运体存在

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