2.2.2动物细胞融合技术与单克隆抗体课件-高二下学期生物人教版选择性必修33

2.2动物细胞工程二、动物细胞融合技术与单克隆抗体什么是动物细胞融合技术？单克隆抗体是如何制备的?在临床上有哪些应用？本节聚焦12A细胞B细胞正在融合的原生质体再生出细胞壁高Ca2+—高pH融合法等脱分化再分化移栽植物细胞融合植物组织培养杂种植株愈伤组织A原生质体B原生质体移栽后的植株植物体细胞杂交技术植物体细胞杂交技术的优势：打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育出新的作物类型。

回顾旧知实验：人——鼠细胞荧光标记融合实验融合细胞细胞融合37℃40min正在融合的细胞红色荧光染料标记膜蛋白绿色荧光染料标记膜蛋白人细胞小鼠细胞有没有技术能让不同种动物的体细胞杂交，培育出集不同细胞的优势于一身的动物细胞呢？

回顾旧知1.概念：2.原理：3.融合方法：4.意义：使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。细胞膜的流动性PEG融合法、电融合法和灭活病毒诱导法等。（化学法、

物理法、

生物法

）突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能。已成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段，特别是杂交瘤技术，为制造单克隆抗体开辟了新途径。动物细胞融合特有杂交细胞：具有原来两个或多个细胞的遗传信息01动物细胞融合技术与诱导植物原生质体融合的方法一样：P37单核

灭活是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构。灭活病毒诱导细胞融合的原理是：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。动物细胞融合实质及完成的标志：细胞核的融合

相关信息2024/4/5

19世纪30年代，科学家曾在患肺结核、天花和麻疹等疾病的病人的病理组织中观察到多核细胞。如何解释这一现象？

病人体内的病毒等诱导多个体细胞融合形成了多核细胞。注意说明动物细胞融合与受精作用的区别（1）受精作用：是在同种生物之间进行的，精子与卵细胞的融合不需要任何诱导剂，受精卵内具备同种生物的两个亲本的遗传物质。（2）动物细胞融合可在不同物种间进行，由于物种间存在生殖隔离，所以自然条件下不能融合成杂交细胞，必须有诱导剂才能融合。形成的杂交细胞具备两个亲本细胞的遗传物质，从而体现两个亲本的遗传特性。植物体细胞杂交动物细胞融合原理细胞融合前的处理方法诱导细胞融合的方法细胞融合成功的标志主要用途意义细胞膜具有一定的流动性、植物细胞的全能性细胞膜具有一定的流动性用果胶酶和纤维素酶去除细胞壁用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散成单个细胞物理法：电融合法、离心法；化学法：聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+-高pH融合法PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法再生出细胞壁细胞核的融合获得完整的杂种植株主要用于制造单克隆抗体打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能2024/4/5动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较《金》P55例11.抗体是什么？由什么细胞分泌产生？早期获得抗体的方法及该方法的缺点?2.在体外培养条件下，如何让一个B淋巴细胞无限增殖?3.给小鼠注射特定抗原的目的是什么？哪里收集B细胞？4.从小鼠体内提取的B淋巴细胞只有一种吗？为什么？5.诱导融合后有多少类杂交细胞（只考虑两两融合）？6.两次筛选的目的和手段分别是什么？7.如何大规模进行培养得到大量的单克隆抗体？单克隆抗体的制备二自主学习P48-P49，小组讨论，解决下列问题：2.早期获得抗体的方法向动物体内反复注射某种抗原→从动物血清中分离所需抗体产量低、纯度低、特异性差缺点：抗原

反复注射动物从动物的血清中分离抗体单克隆抗体的制备二1.抗体的本质是什么？如何产生的？浆细胞抗体(蛋白质）抗原B细胞激活增殖、分化➽若要得到大量的单一抗体，我们该如何去做？3.制造单克隆抗体理论基础：每一个B细胞只分泌一种特异性抗体。B淋巴细胞不能无限增殖

克隆单一的B淋巴细胞，得到的细胞群就能分泌出化学性质单一、特异性强的抗体制备思路：困难：单克隆抗体的制备二克隆单克隆抗体一个已免疫的B淋巴细胞体外培养，不能无限增殖化学性质单一、特异性强分泌英国米尔斯坦德国科勒

由于发明了单克隆抗体的制备技术，米尔斯坦和科勒于1984年获得了诺贝尔生理学或医学奖。大胆设想：B淋巴细胞骨髓瘤细胞（能产生抗体）（能大量增殖）杂交细胞（既能大量增殖，又能产生特定抗体）单克隆抗体的制备二单克隆抗体制备的过程：注射特定的抗原培养骨髓瘤细胞从脾中提取B淋巴细胞多种骨髓瘤细胞诱导融合将骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合①不产生抗体的B细胞：B细胞和记忆B细胞②产生B1、B2、B3等不同抗体的B细胞(浆细胞)目的：

获得能产生相应抗体的B淋巴细胞融合体系中有多少种类型的细胞？未融合的细胞B淋巴细胞相互融合的细胞骨髓瘤细胞相互融合的细胞杂交瘤细胞√单克隆抗体制备的过程：多种杂交细胞未融合的细胞瘤-瘤、B-B、第一次筛选：用特定的选择培养基在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长杂交瘤细胞（既能迅速大量增殖，又能产生抗体）第二次筛选：克隆化培养、抗体检测（多次筛选）抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞用96孔板培养和筛选杂交瘤细胞（每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞）克隆化培养获得能产生所需抗体的杂交瘤细胞分泌的抗体能与特定抗原结合瘤-记B、瘤-B1、瘤-B2、瘤-B3…注射到小鼠腹腔内体外培养单克隆抗体从细胞培养液中提取从小鼠腹水中提取能产生所需抗体的杂交瘤细胞单克隆抗体制备的过程：单克隆抗体的优点：特异性强、灵敏度高、可大量制备单个杂交瘤细胞增殖产生高度纯一的抗体2.制备过程.&1&

.（二）单克隆抗体及其应用3.制备单克隆抗体的过程：动物细胞融合（原理：细胞膜的流动性）

*不是为了得到抗体！第一次筛选：获得杂交瘤细胞

动物细胞培养（原理：细胞增殖）第二次筛选：获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞杂交瘤细胞的特点:优点：能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备应用到的技术：原理：

细胞膜具有一定的流动性、细胞增殖多种杂交细胞及未融合的细胞诱导

融合小鼠骨髓瘤细胞多种B淋巴细胞给小鼠注射特定抗原提取杂交瘤细胞第一次筛选用特定的选择性培养基第二次筛选足够数量的能产生所需抗体的杂交瘤细胞体外培养注射到小鼠腹腔大量单克隆抗体克隆化培养、抗体检测（既能迅速大量增殖，又能产生抗体）（产生抗体）（能无限增殖）从腹腔液中提取从培养液中提取（可进行多次）动物细胞融合动物细胞培养

归纳向小鼠注射特定的抗原培养小鼠骨髓瘤细胞B淋巴细胞骨髓瘤细胞多种细胞多种杂交瘤细胞能分泌所需抗体的杂交瘤细胞第一次筛选：选择培养基第二次筛选：克隆化培养+专一抗体检测注射到小鼠腹腔内增殖体外培养单克隆抗体融合★单克隆抗体制备的过程（既能迅速大量增殖，又能产生抗体）（特异性强、灵敏度高、可大量制备）《金》P56例2、例3；P576、12、14第一次筛选第二次筛选原因方法原理结果诱导融合后得到的细胞中，除杂交瘤细胞之外，还有未融合的亲本细胞，也有融合的具有同种核的细胞由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经第一次筛选之后获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞用特定的选择培养基进行筛选用96孔板培养，在每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞的情况下，进行克隆化培养和抗体检测（进行多次筛选）获得杂交瘤细胞获得能产生所需抗体的杂交瘤细胞两次筛选的比较只有融合的杂交瘤细胞可以生长，其他细胞死亡细胞增殖、抗原抗体特异性结合

第一次筛选的杂交瘤细胞并非都是能分泌所需抗体的细胞，通常用“有限稀释法”来进一步选择。将杂交瘤细胞稀释，用多孔培养板培养细胞，在每孔只有一个杂交瘤细胞的情况下，开始培养，让其增殖。然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体（常用酶联免疫吸附试验法），那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行3～4次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。该过程即为杂交瘤细胞的克隆化培养。“第二次筛选”原理知识延伸克隆化培养多孔培养板抗体检测稀释单个细胞克隆化培养专一抗体检验呈阳性的细胞筛选原因：由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经第一次筛选获得的杂交瘤细胞中存在产生其他抗体的细胞。原理：抗原——抗体特异性结合【原理】将杂交瘤细胞培养液稀释后滴入多孔板，如果稀释度足够高，多孔板的一个孔里就可能只有1个杂交瘤细胞，培养之后(即克隆化培养)，用标记的抗原检测每个小孔上清液里是否含有我们需要的特异性的抗体（抗原抗体能结合即为阳性孔）。这样经过多次克隆化培养以及有限稀释法的筛选，就能选出需要的那种杂交瘤细胞（AB3）。第二次筛选（1）筛选原因：由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经第一次筛选获得的杂交瘤细胞中存在产生其他抗体的细胞。（2）筛选方法：用多孔培养皿培养，在每个孔内只有一个杂交瘤细胞的情况下开始克隆化培养和抗体检测，经多次筛选得到能产生特异性抗体的细胞群。（3）筛选目的：得到能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。杂交瘤细胞多孔培养板克隆化培养和抗体检测筛选抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞既能迅速大量增殖又能产生特异性抗体注意说明阳性孔将杂交瘤细胞群稀释，约每孔1个细胞进行培养（克隆化培养）一段时间后，检测各孔上清液中细胞分泌的抗体上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔多孔细胞培养板抗体检测板分泌抗体能跟特定抗原结合的细胞即为所需杂交瘤细胞“第二次筛选”原理知识延伸《报》40期P38

思考·讨论

单克隆抗体的应用资料1用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做成的“早早孕诊断试剂盒”。在妊娠第8天就可以作出诊断，这比原来的诊断方法提前了10d左右，可以避免孕妇在不知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成不利影响。该方法检测的准确率在90%以上。①作为诊断试剂——最广泛应用

思考·讨论

单克隆抗体的应用讨论：1.ADC的抗体和药物各具有什么作用？资料2使用高效的细胞毒素类药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤细胞。但细胞毒素没有特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害，这限制了它在临床上的应用。抗体-药物偶联物（ADC）通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC通常由抗体、接头和药物(如细胞毒素)三部分组成，它的作用机制如下图所示。抗体：靶向运输药物，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的药物输送到靶细胞。药物：发挥治疗效应，如杀伤靶细胞ADC(2)用于运载药物

思考·讨论

单克隆抗体的应用2.除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物？3.单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势？①可以用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗；②一些作用于细胞信号转导通路的药物可以通过阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长，理论上也可以将这些药物与单克隆抗体结合进行治疗。①检测的特异性和灵敏度大大提高；有利于控制产品的质量和标准化生产诊断试剂盒；②ADC能够协同发挥抗体特异性识别的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点单克隆抗体的应用三单克隆抗体能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备。

利用同位素或荧光标记的单克隆抗体在特定组织中成像的技术，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。1.单克隆抗体的优点：2.