复元胶囊对实验性大鼠膝骨关节炎软骨诱导型一氧化氮合酶及血清一氧化氮、前列腺素e

复元胶囊对实验性大鼠膝骨关节炎软骨诱导型一氧化氮合酶及血清一氧化氮、前列腺素e

骨关节炎（oa）是一种常见的慢性和进展性关节疾病。除了软骨的退行性变外，它还伴有滑膜炎。近年来,OA与炎症介质的关系日益受到人们重视,而一氧化氮(NO)与前列腺素E2(PGE2)两种炎症介质,在OA发病过程中有重要作用。中医认为肾虚血瘀是OA的主要病机,临床上常用补肾活血法治疗OA。复元胶囊(FYJN)组方由治疗OA行之有效的复元汤化载而来,具有补肾活血益气作用。前期研究表明,FYJN能够降低兔膝骨关节炎软骨中白介素1β及滑膜中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达。本实验采用Hulth法建立骨关节炎动物模型,观察FYJN对软骨iNOS表达和血清NO、PGE2含量的影响,探讨其防治OA的抗炎作用机理。1材料和方法1.1材料表面1.1.1动物重庆医科大学实验动物中心提供雄性SD大鼠60只,体重250~300g。动物生产许可证号:SYXK(渝)2002007。1.1.2胶囊的制成FYJN由淫羊藿、鹿茸、肉苁蓉、川芎、当归等组成,由重庆希尔安药业有限责任公司制成胶囊,每粒胶囊重0.41g,每克相当于生药3g,科研制剂批号:12号B-55。塞来昔布(CE):由辉瑞制药有限公司生产,0.2g/粒。1.1.3主试剂1.2方法1.2.1hulth法建立ua模型将60只大鼠随机分为正常组、模型组、CE组、FYJN低、中、高剂量组,每组10只。Hulth法建立OA模型:无菌条件下切断大鼠右膝内侧副韧带、完整切除内侧半月板以及剪断前后交叉韧带。术后肌注青霉素抗感染,共7d。术后1w开始,每天驱赶大鼠跑步30min,共驱赶12w。而正常组不作任何处理。1.2.2灌胃fyjn的单次用药依据Meeh-Rubner公式计算大鼠的等效给药剂量:FYJN低、中、高剂量组分别给予FYJN371.65、743.30、2229.90mg·kg-1·d-1,CE组予CE50mg·kg-1·d-1,正常组、模型组生理盐水灌胃,于术后第2周开始,每天灌胃1次,共12w。1.2.3样品的采集和处理12w后,取右膝股骨内侧髁,4%多聚甲醛固定,10%EDTA脱钙,常规石蜡包埋后切片,留作免疫组化染色。1.2.4血清nos表达量检测(1)光镜观察软骨病理形态:切片常规脱蜡至水后行HE染色。(2)iNOS检测(免疫组化SABC法):切片常规脱蜡至水,3%H2O2封闭内源性过氧化物酶20min,复合抗原修复液抗原修复10min,正常山羊血清封闭,滴加iNOS多克隆抗体(1∶100稀释)4℃过夜,滴加生物素化二抗37℃20min,DAB显色显微镜下观察,苏木精复染1min,烘干、透明、封片。参照Pellerier法,每张切片随机选取5个高倍镜视野(400倍),计算每个视野里的阳性细胞数和细胞总数,用细胞分数即阳性细胞数占细胞总数的百分比来表示iNOS的表达量。(3)硝酸基还原酶法检测血清NO含量:按试剂盒上说明加样混匀后于550nm,0.5cm光径分管光度计测各管吸光度值。(4)酶联免疫吸附法检测血清PGE2含量。1.3统计处理采用SPSS16.0统计软件处理,数据以x±s表示,采用单因素方差分析,有显著差异者,用t检验行两组间比较。2结果2.1软骨细胞排列正常组关节软骨表层光滑,软骨细胞排列整齐、结构层次清楚,基质染色均匀,潮线完整;模型组软骨细胞排列极为紊乱,细胞数目减少、变形,部分区域有大量簇聚软骨细胞,基质染色不均,潮线消失;各药物组软骨细胞排列较模型组整齐,软骨细胞数目增多,潮线断裂,其中,FYJN中、高剂量组与CE组一样软骨细胞形态正常、排列整齐,基质染色也较均匀。2.2各组小鼠in-os表达iNOS阳性表达为胞核/和胞浆出现棕黄色染色。正常关节软骨仅少数几例标本见iNOS散在少量表达。模型组iNOS表达较正常组多,全层软骨细胞均见iN-OS表达。各药物组iNOS表达较模型组少,尤其是FYJN中、高剂量组仅见表中层软骨细胞有少量iNOS表达。FYJN各组iN-OS表达见图1。各组iNOS表达阳性率:FYJN低、中、高剂量组iNOS表达均低于模型组(P<0.05,P<0.01,P<0.001),其中,低剂量组与CE组作用相近。见表1,图1。2.3低剂量组和ce组作用比较FYJN低、中、高剂量组血清NO均低于模型组(P<0.05、P<0.01、P<0.001),其中,低剂量组与CE组作用相近;FYJN低、中、高剂量组血清PGE2含量低于模型组(P<0.05、P<0.01、P<0.001),其中,高剂量组与CE组作用相近。见表1。3讨论3.1小鼠软骨损伤模型Hulth法为经典手术造模方法,其能改变关节应力。在此基础上驱赶大鼠跑步,加速软骨破坏,具有造模时间短、成功率高的特点。用鼠类来诱导OA模型,其软骨损伤较大型动物更迅速,更有利于抗骨关节药物研究。实验结果显示术后12w后即可获得典型的膝OA模型。3.2no的检测作为软骨组织中唯一的细胞成分,软骨细胞在受到机械和化学因素刺激下,持续表达iNOS。过多产生的iNOS催化L-左型精氨酸产生大量NO,从而抑制蛋白多糖和胶原合成、激活金属蛋白酶、诱导细胞凋亡、调节炎症反应等。NO有脂溶性,极易通过细胞膜扩散进入血液循环,因此检测血液中NO浓度能反应局部NO释放量,间接反映软骨的损害程度。本实验结果提示OA与iNOS表达增加及NO过度生成有关,FYJN能有效抑制软骨iN-OS表达,从而减少NO产生,且这种抑制作用随FYJN剂量增加而增强。3.3pge2核心在关节软骨降解和OA病理进程中,PGE2是最主要的分解代谢因子之一。Attur等报道在体外培养人OA软骨细胞中PGE2通过EP4受体途径抑制蛋白多糖合成并刺激基质降解。PGE2参与炎症反应、致痛、影响血管扩张及生成,从而产生症状。目前临床上广泛用于治疗OA的最主要药物——非甾体抗炎剂(NSAIDs)就是通过抑制环氧合酶,使PGE2的合成减少而达到消炎、镇痛的作用。本实验结果提示FYJN能有效抑制PGE2产生,从而达到抗炎、镇痛的治疗作用。3.4时药治疗对aa治疗OA相当于中医“骨痹”范畴。“肾主骨、藏精、生髓”,OA与肾虚相关。《中藏经·五痹》谓“骨痹者,乃嗜欲不节,伤于肾也……则邪气妄入”,指出风寒湿邪内搏于骨,气血痹阻经络是本病的重要病机。故OA治疗应注重补肾与活血并重。中医药在治疗OA方面积累了丰富的经验,梁祖建等人的实验研究表明补肾活血中药可以抑制炎症,对OA的软骨有保护和促进修复作用。FYJN是临床上治疗OA有效制剂,由淫羊藿、鹿茸、肉苁蓉、川