备课素材：反向PCR技术 第二学期高中生物学选择性必修三

反向PCR技术反向PCR是用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段，而常规PCR扩增的是已知序列的两引物之间DNA片段。实验时选择已知序列内部没有切点的限制性内切酶对该段DNA进行酶切，然后用连接酶使带有黏性末端的靶序列环化连接，再用一对反向的引物进行PCR，其扩增产物将含有两引物外未知序列，从而对未知序进行分析研究。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR技术由变性－退火－延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性－退火－延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。随着科学技术的不断发展，科研人员在基本PCR的基础上进行了大量改进，开发了许多适用于不同研究目的的PCR，如兼并引物PCR、套式引物PCR、反向PCR、不对称PCR、逆转录PCR、实时PCR等。什么是反向PCR呢？和常规PCR有什么区别？反向PCR（IPCR）技术是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段，对某个已知DNA片段两侧的末知序列进行扩增。如图所示：基本PCR与反向PCR技术的区别：反向PCR(reversePCR)是用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段，而常规PCR扩增的是已知序列的两引物之间DNA片段。反向PCR是常规聚合酶链反应技术的修改和发展。反向PCR技术的原理、方法和意义：实验时选择已知序列内部没有切点的限制性内切酶对该段DNA进行酶切，然后用连接酶使带有黏性末端的靶序列环化连接，再用一对反向的引物进行PCR，其扩增产物将含有两引物外未知序列，从而对未知序进行分析研究。反向PCR可用于研究与已知DNA区段相连接的未知染色体序列，因此又可称为染色体缓移或染色体步移。反向PCR是克隆T-DNA插入位点侧翼DNA序列非常有效的方法。如图所示：现已制备了酵母人工染色体（YAC）大的线状DNA片段的杂交探针，这对于转座子插入序列的确定和基因库染色体上DNA片段序列的识别十分重要。反向PCR技术的应用：反向PCR设计之初是为了用于确定邻近未知区域的序列，多用于研究基因的启动子序列；致癌性染色体重排，如基因融合、易位和转座；以及病毒基因整合，现在也常用于定点突变，复制一个具有预期突变的质粒。反向PCR技术的不足：需要从许多酶中选择限制酶，或者说必须选择一种合适的酶进行酶切才能得到合理大小的DNA片段。这种选择不能在非酶切位点切断靶DNA。大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列，而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有时也会有这些序列，这样，通过反向PCR得到的探针就有可能与多个基因序列杂交。反向PCR技术有着自己独特的特点，虽然有不足之处，但它在各学科和各领域都有着重要的作用。随着PCR技术和分子生物学的发展，它在各学科和各领域的作用将会越来越重要，应用也将会更加普遍。例、反向PCR是一种通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术，其过程如下图所示。下列叙述正确的是（

）A．应选择引物1和引物4进行PCR扩增B．设计的引物中GC碱基含量越高，退火的温度越低C．PCR产物是包含所有已知序列和未知序列的环状DNA分子D．整个过程需用到限制酶、DNA连接酶、耐高温DNA聚合酶及逆转录酶解析：由题目中的反向PCR技术可知，通过已知序列设计引物，来扩增未知序列，因此，引物延伸的方向应该是向未知序列，由左图