第十六章 流式细胞术及其临床应用进展

本章主要学习内容和要求主要学习内容要求流式细胞术的细胞参量与荧光探针

流式细胞术常用的临床检测项目临床疾病的流式细胞术分析掌握

第十六章流式细胞术及其临床应用进展

流式细胞术的原理

熟悉了解流式细胞术常用的临床检测项目返回上一页下一页第一节概述

一、细胞功能分析的重要性

(一）细胞组学的概念

细胞组学是在多个细胞组并存的细胞异质群体中，应用多参数细胞分析技术，获得由细胞遗传和外界环境影响的细胞分子表型的最精确、最大量的信息。（二）细胞组学的研究特点

细胞组学是在单细胞水平上进行分析，反映了细胞的真实状态，避免因组织或细胞体系不同细胞之间存在的异质性而造成研究结果的偏差。细胞组学的思路与传统研究不同，传统的研究策略主要立足于对各个基因功能的研究，然后再考察它们在细胞中的作用以及相互联系，而细胞组学则集中于细胞中分子表型的分析。细胞组学是在单细胞水平上蛋白质组和基因组研究的结合，阐明细胞(组)功能与蛋白质组关系的科学。（三）流式细胞术是研究细胞（组学）功能的有力工具

FCM是研究细胞（组学）功能的有力工具，采用流式细胞仪对细胞悬液进行快速分析，通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测，得到该细胞的光散射和荧光指标，分析出其体积、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等物理及化学特征。

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二、流式细胞术的发展趋势（一）从相对细胞计数到绝对细胞计数

艾滋病患者的血液中辅助/诱导T细胞（CD3+CD4+CD8﹣）＜200个/μl，而仅有HIV感染而未发病者的该细胞数则＞200个/μl。

（二）从相对定量到绝对定量分析

传统多以平均荧光强度（MFI）或相对荧光强度（RFI）表示细胞抗原或受体表达含量。由于系统误差及所用仪器的型号不同，以MFI或RFI表示缺乏可比性。定量流式细胞术（Quantitativeflowcytometry，QFCM）应用定量抗体微球法和定量荧光素分子微球法可获得每个细胞上的平均抗原分子数。（三）从单色到多色荧光分析

新的荧光色素分子的不断发现，荧光标记技术的进步和流式细胞仪的多激光激发等技术的进展，多色荧光分析得到迅速发展，三色、四色甚至五色或六色荧光分析对细胞亚群的识别、细胞功能评价等更为精确。上一页下一页返回第一节概述

二、流式细胞术的发展趋势（四）从细胞膜成份到细胞内成份分析近年来细胞内成分检测技术的不断完善，细胞内成分检测已成为流式细胞分析的又一个热点，通过细胞内成分检测技术与多色免疫荧光分析方法结合，可检测不同细胞亚群合成的不同细胞因子。（五）液体中可溶性成分的流式细胞分析近年来发展起来的流式微球分析（cytometricbeadassay，CBA）技术，可分析液体中的可溶性成分。（六）流式分子表型分析流式分子表型分析（molecularphenotyping）是指用流式细胞技术检测细胞中特异性核酸序列或特异性基因异常。上一页下一页返回第二节流式细胞术的原理

一、流式细胞仪的基本结构与功能流式细胞仪主要由以下五部分构成:(一）流动室及液流驱动系统（FlowCell或FlowChamber）流动室是流式细胞仪的核心部件，单细胞悬液在细胞流动室里被鞘流液包绕通过流动室内的一定孔径的孔,检测区在该孔的中心，细胞在此与激光垂直相交，在鞘流液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测。流动室里的鞘液流是一种稳定流动。控制鞘液流的装置是在流体力学理论的指导下由一系列压力系统、压力感受器组成，只要调整好鞘液压力和标本管压力,鞘液流包绕样品流并使样品流保持在液流的轴线方向，能够保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而使激光激发的荧光信息准确无误。流动室及液流驱动系统（FlowCell或FlowChamber）上一页下一页返回第二节流式细胞术的原理

激光光源及光束形成系统

（二）激光光源及光束形成系统常用的激光管是氩离子气体激光管，它的发射光波长488ηm,此外可配备氦氖离子气体激光管（波长633ηm）和/或紫外激光管。在激光光源和流动室之间有两个圆柱形透镜，将激光光源发出的横截面为圆形的激光光束聚焦成横截面较小的椭圆形激光光束使通过激光检测区的细胞受照强度一致。流式细胞仪的主要测定信号荧光是由激发光激发的，荧光信号的强弱与激发光的强度和照射时间相关。

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荧光信号检测系统应用荧光标记的单克隆抗体染色进行多色分析，荧光信号的强弱，反映了细胞抗原表达的含量。（三）光学系统

流式细胞仪的光学系统由若干组透镜、小孔、滤光片组成，大致可分为流动室前和流动室后两组。流动室前的光学系统由透镜和小孔组成，透镜和小孔（一般为2片透镜、1个小孔）的主要作用是将激光光源发出的横截面为圆形的激光光束聚焦成横截面较小的椭圆形激光光束，使激光能量成正态分布，通过激光检测区的细胞受照强度一致，最大限度地减少杂散光的干扰。流动室后的光学系统主要由多组滤光片组成，滤光片的主要作用是将不同波长的荧光信号送到不同的光电倍增管。上一页下一页返回第二节流式细胞术的原理

散射光信号监测系统（四）信号检测与存储、显示、分析系统细胞成单行排列依次通过激光检测区时产生散射光和荧光信号,散射光分为前向角散射（FS）和侧向角散射（SS）。前向角散射（FS）反映被测细胞的大小,它由正对着流动室的光电二极管装置接收并转变为电信号；侧向角散射或900散射（SS）反映被测细胞的细胞膜、细胞质、核膜的折射率和细胞内颗粒的性状,它由一个光电倍增管(PMT)接收并转变为电信号存储在流式细胞仪的计算机内。上一页下一页返回第二节流式细胞术的原理

细胞分选系统(cellsortingsestem)

引自/uplo-adfiles/images(五)细胞分选系统

在细胞流动室上装有超声压电晶体,通电后超声压电晶体发生高频震动，可带动细胞流动室高频震动,使细胞流动室喷咀流出的液流束断成一连串均匀的液滴,每秒钟形成液滴上万个。每个液滴中包含着一个样品细胞,液滴中的细胞在形成液滴前已被测量,如符合预定要求则可被充电,在通过偏转板的高压静电场时向左或向右偏转被收集在指定容器中,不含细胞液滴或细胞不符合预定要求液滴不被充电亦不发生偏转进入中间废液收集器中,从而实现了分选。上一页下一页返回第二节流式细胞术的原理

二、常用荧光染料的激发光和发射光波长荧光素激发光波长（nm）发射光峰值（nm）FITC488525（绿）PE488575（橙红）PI488630（橙红）ECD488610（红）CY5488675（深红）PreCP488675（深红）

各种荧光信号由各自的光电倍增管(PMT)接收并转变为电信号后存储在流式细胞仪的计算机硬盘或软盘内。上一页下一页返回第二节流式细胞术的原理

三、流式细胞术的数据显示

1．单参数数据显示和分析

单参数直方图图中横坐标是FITC荧光信号相对强度值（对数），纵坐标表示细胞数;图中已根据阴性对照设定适当的“门”（直线门），仪器的计算机就会给出测定值（包括阳性细胞%和平均荧光强度）

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2.双参数数据显示和分析

三、流式细胞术的数据显示

外周血白细胞散射光双参数点图正常人外周血白细胞的前向散射光（FS）和侧向散射光（SS）组成的点阵图，横坐标和纵坐标均是线性的，图中淋巴细胞、单核细胞、粒细胞很明显地分为3群，可以很容易地圈“门”分析各亚群细胞的数据。

上一页下一页返回第二节流式细胞术的原理三、流式细胞术的数据显示3．三参数数据显示和分析

三色淋巴细胞亚群分析a,b:淋巴细胞经CD4-FITC,CD8-PEandCD3-PC5标记c:分光图（prism）表示三个荧光数据关系,显示8组数据CD3+CD4+Th细胞CD3+CD8+Ts细胞abcCD3+CD4+Th细胞CD3+CD8+Ts细胞上一页下一页返回第二节流式细胞术的原理四、流式细胞术分析的原理及流程

（一）细胞分析

流式细胞术可同时进行多参数测量，信息主要来自特异性荧光信号及非荧光散射信号。液流中央的单个细胞通过测量区时，受到激光照射会向立体角为2π的整个空间散射光线，散射光的强度及其空间分布与细胞的大小、形态、质膜和细胞内部结构密切相关。在流式细胞术测量中，常用两种散射方向的散射光测量：前向角（即0°角）散射（FSC）与侧向散射（SSC），又称90°角散射。FSC与细胞的大小有关，SSC主要用来获取有关细胞内部精细结构的颗粒度。荧光信号主要包括自发荧光：即不经荧光染色细胞内部的荧光分子经光照射后所发出的荧光；特征荧光：经特异荧光染色而发出的荧光。自发荧光信号为噪声信号，细胞成分中如核黄素、细胞色素等的含量越高，自发荧光越强；培养细胞中死细胞越高，自发荧光越强；细胞样品中所含亮细胞的比例越高，自发荧光越强。

上一页下一页返回第二节流式细胞术的原理四、流式细胞术分析的原理及流程

（二）细胞分选分选原理是把液滴形成的信号加在压电晶体上使之产生机械振动，使液柱断列成均匀的液滴，一部分液滴中包有细胞，如果其特征与被分选的细胞特征相符，则仪器在这个被选定的细胞形成液滴时就充以特定的电荷，而未被选定细胞形成的细胞液滴和不包含细胞的空白液滴不被充电。带有电荷的液滴向下落入偏转板的高压静电场时，按照所带电荷符号向左或向右偏转，落入指定的收集器内，完成分类收集的目的。（三）流式细胞仪的主要技术指标①分析速度，大型机可达每秒上万个细胞；②荧光检测灵敏度，测出单个细胞﹤600个荧光分子,两个细胞间的荧光差＞5%即可区分；③（FSC）光检测灵敏度，FSC反映被测细胞的大小,一般能够测量到

0.2μm～０.5μm；④分辨率，通常用变异系数CV值来表示，能够达到﹤2.0%；⑤分选速度，＞1000个/秒，分选细胞纯度可达99%以上。

上一页下一页返回第三节流式细胞术的细胞参量与荧光探针一、测试DNA和RNA含量的荧光探针：碘化丙啶（PI）和溴化乙啶（EB）

大鼠肝细胞DNA含量分析上一页下一页返回第三节流式细胞术的细胞参量与荧光探针二、测试DNA碱基组成的荧光探针双链DNA的碱基对结构受到所组装分子碱基组成的约束(A=T,G=C）,在各物种中，（A+T）对于（G+C）的比例是不同的。在人类细胞接近1，而在细菌中比例是不同。由于HO(Hoechst)特异地和AT碱基对结合，CA3(Chro-momycinA3)特异地和GC碱基对相结合，利用HO／CA3双染可以分析DNA的碱基组成,区别不同种类的细菌。三、测试染色质结构的荧光探针用酸变性或热变性等方法使DNA部分变性。变性的部分由双链变成单链。丫啶橙(Acridineorange,A0)标记后，凡是已变性的单链核酸由发绿色荧光变为发红色荧光，所以红色荧光的强度说明染色质变性的程度。由于细胞周期各时相中，染色质的凝集程度不同，经酸或热处理后，变性程度也不同，染色质越凝集，对酸和热变性越敏感。用这种方法可区分出细胞周期各时相如G0、G1、S、G2和M期细胞。四、测试细胞总蛋白含量的荧光探针测定总蛋白含量能检测一个细胞群体生长和代谢的状态，也可以区别任何不同蛋白含量的细胞亚群，FITC是检测总蛋白最常用的荧光探针。它是酸性染料，以共价键方式结合到蛋白的带有正电荷的基团上，以蓝光激发后，发出明亮的绿色荧光。FITC不能穿过活细胞的膜，若丹明640能对活细胞的蛋白进行染色。上一页下一页返回第三节流式细胞术的细胞参量与荧光探针

五、抗体和其它分子的共价标记荧光探针染料B-藻红蛋白R-藻红蛋白C-藻青蛋白别藻青蛋白R-藻青蛋白FITC四甲基若丹明X-RITC德州红分子量近似值240000240000224000104000103000390444547625消光系数2410000196000016000007000007600008000079500084000吸收峰(nm)545565490545565620650555618495555582596发射峰(nm)575578650660634525582601615量子产额0.980.800.510.680.70.50.20.51上一页下一页返回第三节流式细胞术的细胞参量与荧光探针六、测试细胞活性的荧光探针两类荧光探针判断细胞的活性，一类是能透过活的细胞膜进入细胞的分子，如FDA（二醋酸酯荧光素）；另一类是不能透过活细胞膜进入细胞中，但能对固定的细胞、膜有缺损的细胞核进行染色的荧光探针，如PI或EB。七、测试DNA合成的荧光探针采用BrdU单克隆抗体免疫荧光技术检测细胞DNA合成。

八、测试细胞膜电位的荧光探针，检测膜电位比较常用的亲脂性阳离子荧光染料为Cyanine（花青苷）和Rhodamine123（若丹明123）。九、测试细胞内pH的荧光探针细胞内pH、膜电位和细胞内钙都是细胞激活过程中重要的细胞参量。pH荧光探针很多，较常用的BCECF（

二羧乙基一5，6羧基荧光素）和6－COFDA（6-羧基二醋酸酯荧光素）。十、测试细胞内钙的荧光探针荧光染料主要有5种：Quin-2、Indo-1、Fura-2、Fluo-3和Rhod-2、它们都是钙鳌合剂EGTA的衍生物，有较高的量子产额并对钙有较高的特异性亲合力。

十一、测试细胞膜的流动性或微粘度的荧光探针通过测量结合到膜双分子层中的疏水荧光探针的荧光偏振度来研究。

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一、淋巴细胞亚群分析

淋巴细胞亚群分析可以通过相对计数、绝对计数与率的变化监控。（一）检测原理单克隆抗体特异与淋巴细胞表面的抗原结合，经多色荧光染料标记，即可以把各种不同功能的淋巴亚群区分开来（二）临床意义1．CD3+CD3+T细胞增高见于某些自身免疫性疾病（如SLE）、重症肌无力、慢性活动性肝炎等；CD3+T淋巴细胞数减低见于某些白血病、应用免疫抑制剂、放疗过程中、先天性细胞免疫缺陷、艾滋病等2．CD4+T细胞下降常见于某些病毒感染性疾病，如艾滋病、巨细胞病毒感染、严重创伤、全身麻醉、大手术、应用免疫抑制剂（如环孢霉素A）等；而类风湿性关节炎活动期CD4+T细胞则升高。3．CD8+T细胞下降常见于类风湿性关节炎、干燥综合征、重症肌无力等；而传染性单核细胞增多症急性期、巨细胞病毒感染等，CD8+T细胞常升高。4．CD4+/CD8+细胞比值下降，常见于艾滋病、瘤型麻风病、恶性肿瘤进行期和复发时；CD4+/CD8+细胞比值升高，见于类风湿关节炎活动期、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、干燥综合征、重症肌无力及器官移植后排斥反应等。上一页下一页返回第四节流式细胞术常用的临床检测项目

一、淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析可以通过相对计数、绝对计数与率的变化监控。（一）检测原理单克隆抗体特异与淋巴细胞表面的抗原结合，经多色荧光染料标记，即可以把各种不同功能的淋巴亚群区分开来

CD3+CD4+Th细胞CD3+CD8+Ts细胞上一页下一页返回第四节流式细胞术常用的临床检测项目

一、淋巴细胞亚群分析

（二）临床意义1．CD3+T细胞增高见于某些自身免疫性疾病如SLE、重症肌无力、慢性活动性肝炎等；CD3+T淋巴细胞数减低见于某些白血病、应用免疫抑制剂、放疗过程中、先天性细胞免疫缺陷、艾滋病等2．CD4+T细胞下降常见于某些病毒感染性疾病，如艾滋病、巨细胞病毒感染、严重创伤、全身麻醉、大手术、应用免疫抑制剂（如环孢霉素A）等；而类风湿性关节炎活动期CD4+T细胞则升高。3．CD8+T细胞下降常见于类风湿性关节炎、干燥综合征、重症肌无力等；而传染性单核细胞增多症急性期、巨细胞病毒感染等，CD8+T细胞常升高。4．CD4+/CD8+细胞比值下降，常见于艾滋病、瘤型麻风病、恶性肿瘤进行期和复发时；CD4+/CD8+细胞比值升高，见于类风湿关节炎活动期、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、干燥综合征、重症肌无力及器官移植后排斥反应等。上一页下一页返回第四节流式细胞术常用的临床检测项目

二、细胞周期、细胞凋亡、DNA倍体分析肿瘤细胞的细胞周期、细胞凋亡、DNA倍体分析是流式技术在临床的重要应用，临床上可对一些恶性肿瘤进行早期诊断、早期治疗及跟踪随访，可明显改善一些肿瘤的治愈率和生存率。（一）检测原理多发性骨髓瘤正常人骨髓细胞DNA分析上一页下一页返回第四节流式细胞术常用的临床检测项目

二、细胞周期、细胞凋亡、DNA倍体分析

肿瘤细胞的细胞周期、细胞凋亡、DNA倍体分析是流式技术在临床的重要应用，临床上可对一些恶性肿瘤进行早期诊断、早期治疗及跟踪随访，可明显改善一些肿瘤的治愈率和生存率。

1.发现癌前病变，协助肿瘤早期诊断

2.提示癌前病变的癌变发生率与细胞不典型增生程度的相关性

3.在肿瘤的诊断、预后判断和治疗中的作用

4.指导化疗方案

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Anti–IFN–gCD69Activation37℃IncubationIntracellularStainLyse/FixAcqusitionPermeabilizelymphocyteerythrocytestimulusSurfaceStainWashcytokineWashWashproteinblocking第四节流式细胞术常用的临床检测项目三、细胞因子的检测

cytokine是由免疫细胞或非免疫细胞合成和分泌的小分子多肽,在调节机体多种细胞的生长、分化和功能,调节正常与病理状态下的免疫应答过程中起着十分重要的作用。（一）检测原理

上一页下一页返回第四节流式细胞术常用的临床检测项目三、细胞因子的检测(二）临床意义临床最常见的检测是Th1/Th2、Tc1/Tc2分析。根据活化TC分泌细胞因子的种类，可将CD4＋、CD8＋T细胞分为：

CD4＋细胞：Th1（CD4＋、IFNr＋）

Th2（CD4＋、IL-4＋）

Th0（CD4＋、IFNr+、IL-4＋）

CD8＋细胞：Tc1（CD8＋、IFNr＋）

Tc2（CD8＋、IL-4＋）

1.Th1细胞可介导细胞免疫、细胞毒性T细胞的生长与活化、巨噬细胞的活化，介导迟发型过敏反应，介导器官移植免疫排斥反应，其功能亢进可导致自身免疫病。2.Th2细胞可介导体液免疫，促进B细胞生长和分化过程。3.Th1/Th2细胞比值两者平衡偏移多见于感染、自身免疫病、过敏、免疫缺陷及肿瘤恶化。4.Th1/Th2可用于分析疾病发生发展，为临床调整Th1/Th2的细胞平衡提供科学的治疗依据。上一页下一页返回缺铁性贫血4.78%正常人网织红细胞1.07%再障（AA)0.03%溶血性贫血（HA)29.33%计数精确低水平网织红细胞检测操作快速、简便(二）临床意义1.预测骨髓移植效果2.贫血诊断及鉴别诊断3.评价疗效第四节流式细胞术常用的临床检测项目

四、网织红细胞分析

网织红细胞（reticulocyte）是介于晚幼红细胞和成熟红细胞之间尚未完全成熟的红细胞。计数外周血中网织红细胞数量,对于评价骨髓红系造血及网织红细胞从骨髓到外周血的转送速率有重要意义。

（一）检测原理

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五、血小板功能分析及血小板疾病诊断

通过血小板膜糖蛋白的检测可以诊断先天性或获得性血小板疾病

（一）检测原理血小板膜上有丰富的糖蛋白受体，是血小板发挥其功能的物质基础，静止期和活化期血小板的膜糖蛋白受体的种类、含量、结构和功能显著不同，用不同的抗血小板单克隆抗体可测定和分析血小板功能状态。血小板膜糖蛋白复合物诊断血小板缺陷性疾病

CD41-CD61复合物：血小板无力症

CD42a-CD42b复合物：巨大血小板症血小板活化的相关检查 血小板颗粒膜糖蛋白，如CD62，CD63

血小板膜糖蛋白活化表位，如PAC-1血小板减少性疾病 血小板自身抗体检测 网织血小板的检测血小板脱落微粒的检测上一页下一页返回第四节流式细胞术常用的临床检测项目五、血小板功能分析及血小板疾病诊断（二）临床意义1.评价血小板活化程度的应用领域，包括：缺血性冠状动脉疾病如心绞痛、心梗死、血管成形术、心肺旁路术等；缺血性脑血管病如脑梗塞、TIA、脑动脉硬化等；高血压病、高脂蛋白血症、高粘滞血症等；抗血小板药物机制研究与疗效监测等；糖尿病及恶性肿瘤等。2.血小板相关抗体抗血小板自身抗体包括原发性、药物诱导产生、合并其它自身免疫性疾病如SLE能引起严重的血小板减少。大多数原发性(免疫性)血小板减少性紫癜病人血小板上和/或血清中有抗自身血小板的血小板相关抗体PAIgG、PAIgA、PAIgM。3．血小板无力症血小板无力症时血小板膜GPIIb/IIIa明显减少，用血小板质膜糖蛋白单克隆抗体CD41、CD61和流式细胞仪测定不仅可测出GPIIb/IIIa减少，CD42a、CD42b基本正常或偏高，还可测出GPIIb/IIIa减少程度，分类血小板无力症。4.巨大血小板综合征（BSS）血小板巨大,CD42a减少，CD42b减少，CD61增加。上一页下一页返回第四节流式细胞术常用的临床检测项目

六、HLA-B27检测（一）检测原理检测选用CD3/HLA-B27双标记抗体，圈定T淋巴细胞亚群，再分析其细胞表面是否表现HLA-B27组织抗原。

（二）临床意义1.诊断强直性脊柱炎HLA-B27与许多脊柱关节病密切相关，其中最具代表性的是强直性脊柱炎。90%的强直性脊柱炎患者HLA-B27检测阳性，而普通人群的阳性率只有4%-8%。

2.其它疾病HLA-B27还与Reiter综合症（阳性率70%-90%）、银屑病性关节炎（阳性率50%-60%）、急性前葡萄膜炎（40%-50%）和溃疡性结肠炎伴关节病（5%-10%）等许多严重危害人类健康的脊柱性关节病相关。

3.HLA-B27基因型阳性的个体，患遗传性免疫疾病的机率，比一般人要高很多，以强直性脊柱炎为例，约为87倍。因此HLA-B27检测可以有效帮助临床鉴别诊断强直性脊柱炎等血清阴性骨关节疾病。

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七、流式细胞术在临床细菌学中的应用

可检测病原菌、毒素和血清抗体,还可用于抗生素敏感性试验,对抗生素后效应、细菌耐药的异质性等进行分析。（一）病原菌、毒素和血清抗体的检测1.荧光染料直接检测细菌;2.免疫荧光检测细菌;3.FCM-RFLP检测细菌（二）FCM在抗生素敏感性试验中的应用

FCM与荧光染料的联合运用可判断细菌活力和功能状态,由于速度快,该方法已被建议用作临床实验室的常规药敏试验。（三）细菌耐药的异质性检测

FCM能通过不同细菌亚群对抗生素的敏感性不同,直观地表现细菌的异质性,从而有助于诊断不同细菌亚群引起的混合感染,以便提供正确的治疗方案。（四）流式细胞术在其他病原微生物检测中的应用1.抗真菌药物的活性测定;2.衣原体、支原体的检测

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八、流式细胞术病毒检测（一）病毒抗原的检测与定量1.利用单克隆抗体检测不同时期的CMV抗原可诊断CMV感染

;2.肝炎病毒标志物的定量及动态检测;3.HSV1,HSV2和HHV8受染细胞内HSV抗原的检测;4.细胞内p24、p17、nef、gp120、gp160/gp41表达的检测;5．测定逆转录病毒滴度;（二）病毒核酸的检测与定量

检测原理：原位杂交FCM技术可检出外周血样中少见的产病毒细胞,经固定的悬液细胞,与标记有地高辛11-脱氧三磷酸尿苷(11dUTP)的HIV-1基因探针杂交,然后与荧光标记的抗地高辛抗体反应,最后对由此产生的荧光信号作FCM分析便可检出受染细胞的HIV-RNA。

（三）病毒抗体检测

利用吸附有病毒抗原的聚苯乙烯微球作为载体的病毒抗体FCM分析技术已广泛应用。利用不同大小的微球,分别包被特异性病毒抗原后,可同时检测多种病毒抗体,如CMV和HSV抗体,或同时检出HIV-1的抗p31、gp120、gp41抗体,并可定量。上一页下一页返回第五节临床疾病的流式细胞术分析

一、流式细胞术在免疫生物学和免疫技术研究中的应用（一）细胞表面标记及抗原决定簇性质的研究

1.血液系统细胞表面标记

2.细胞群体及细胞表面标记变化的检测

3.细胞表面抗原决定簇性质的研究

4.细胞表面标记分子的定量分析（二）细胞抗原表达的研究

1.抗原表达与遗传学基础的研究

2.抗原表达同细胞周期的关系研究

3.细胞不同生长期抗原表达的观察

4.细胞生长环境与抗原表达的研究

(三)免疫和肿瘤细胞测定及分选中的应用

1．细胞周期中静止细胞的分离

2．人外周血嗜碱细胞的分离

3．外周血变异红细胞的鉴定

4．从母体循环中分离出胎儿细胞

5．检测免疫功能测定上一页下一页返回第五节临床疾病的流式细胞术分析

二、流式细胞术在临床免疫学中的应用（一）总体区分淋巴细胞亚群

1.T细胞表面标志的检测

:CD3+,CD4+,CD8+2.B细胞表面标志的检测

:CD19+,CD20+3.NK细胞表面标志的检测

:CD57+,CD56+,CD16+（二）区分功能性淋巴细胞亚群

1．T细胞亚群的功能区分

抑制性T细胞（Ts）的表面标志

CD8+CD28-

细胞毒性T细胞（Tc）表面标志

CD8+CD28+

辅助性T细胞（Th）表面标志

CD4+CD29+

诱导性T细胞（Ti）的表面标志

CD4+CD45RA+2．B细胞亚群的区分

B1亚群:CD5+CD19-;B2亚群:CD5+CD19+3．根据活化T淋巴细胞分泌细胞因子的种类

4．区分活化淋巴细胞亚群

活化总T:CD3+/HLA-DR+；静止总T:为CD3+/HLA-DR-；活化CD4+:CD4+/HLA-DR+；活化CD8+:CD8+/HLA-DR+；活化诱导分子为

CD69+细胞；CD4＋细胞Th1（CD4＋、IFNr＋）

Th2（CD4＋、IL-4＋）

Th0（CD4＋、IFNr+、IL-4＋）CD8＋细胞Tc1（CD8＋、IFNr＋）

Tc2（CD8＋、IL-4＋）

Tc0（CD8＋、IFNr＋、IL-4＋）上一页下一页返回第五节临床疾病的流式细胞术分析

二、流式细胞术在临床免疫学中的应用(三)FCM在临床免疫性相关疾病及其免疫功能检测的应用

1．检测I型变态反应（过敏性哮喘）时的介导分子

2．检测HLA抗原

HLA-B7/B-27;HLA-DR,HLA-DP,HLA-DQ3．细胞因子受体检测

4．T细胞受体库检测

TCRγ／δ;TCRα／β;TCRν／β5．机体免疫功能监测的应用主要用于自身免疫性疾病、变态反应性疾病、免疫缺陷性疾病、感染性疾病（病毒、细菌、寄生虫感染）相关抗原、免疫治疗、肿瘤免疫及移植免疫的监测

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三、流式细胞术分析在血液系统疾病检测的应用（一）白血病和淋巴瘤免疫分型

1．白血病免疫分型诊断标准(EGIL)标准

（1）B淋巴细胞系白血病的分型

Pro-B-ALL(BI型):CD19+,或/和CD22+,或/和CD79a+CommonALL(BII型)：CD19+,或/和CD22+,或/和CD79a+,CD10+Pre-B-ALL(BIII型):CD19+,或/和CD22+,或/和CD79a+,CyIgM+

成熟-B-ALL(BIV型):CD19+,或/和CD22+,或/和CD79a+，

Kappa/Lambda+

(2)T淋巴细胞系白血病的分型

Pre-T-ALL(TI型)：CD3+,CD7+Pre-T-ALL(TII型)：CD3+,CD2+，CD5+,CD8+

皮质-T-ALL(TIII型)：CD3+,CD1a+

成熟-T-ALL(TIV型)：CD3+,CD1a+,Anti-TCR＋α/β+或γ/δ＋上一页下一页返回第五节临床疾病的流式细胞术分析

三、流式细胞术分析在血液系统疾病检测的应用（一）白血病和淋巴瘤免疫分型

1．白血病免疫分型诊断标准(EGIL)标准

(3)急性髓性白血病(AML)的分型亚型常表达抗原

M0CD11bCD13或CD33M1CD13CD15CD33CD34HLA-DRCD56CD19M2CD11bCD13CD15CD33CD34M3CD11bCD13CD15CD33CD34M4CD4CD11bCD13CD14CD15CD33CD34M5CD4CD11bCD13CD14CD15CD33CD34