锁阳多糖、水提取物咀嚼片对衰老大鼠的干预效应

锁阳多糖、水提取物咀嚼片对衰老大鼠的干预效应

锁阳是一种非老药、铁锤、性甜、温暖、补肾、助阳、益精等功效。现代医学从药理实验及临床等方面均研究证明锁阳具有调节免疫内分泌、抗衰老、改善性功能、润肠通便等多种生理活性,是治疗老年性疾病、延缓衰老的理想药物。大量研究表明,衰老的发展与免疫系统、神经系统功能的减退,自由基代谢等密切相关。本实验研究是在中医理论指导下,利用现代医学技术结合中药制剂研究,探讨锁阳提取物咀嚼片延缓衰老的效应及其作用机制。1试剂和测试仪器Wistar大鼠,体重(200±20)g;由甘肃中医学院实验动物中心提供。78X-2型片剂四用测定仪;自动酶标分析仪;CO2培养箱;SOD、MDA、NO测试盒由南京建成生物工程研究所提供;RPMI1640购于GIBCOBRL公司;小牛血清为hyclone产品;ConA为sigma产品;二甲基亚酚购于宝泰克公司;四甲基偶氮唑盐(MTT)购于FlukaAG,中国分装;D-半乳糖购于上海恒信化学试剂有限公司;维生素E为海南制药厂有限公司产品;其余试剂均为国产分析纯。1.3mda和no的检测锁阳加水回流提取2次。第一次加10倍量水,时间1.5h;第二次加水6倍量,时间1.0h,提取温度100℃,合并两次提取液。常压浓缩至生药1g/ml(药液),加乙醇至50%静置24h。滤过,滤液回流乙醇浓缩至稠膏状(D1.40),60℃常压烘干。粉碎至40目,加入乳糖、甘露醇。提取物∶乳糖∶甘露醇比例为3∶1∶1,湿法制粒压片(1g相当于3.3g生药,成人量7.8g/d)。锁阳加水回流提取2次。第一次加10倍量水,时间1.5h;第二次加水6倍量,时间1.0h,提取温度100℃,合并两次提取液。常压浓缩至生药1g/ml(药液),加乙醇至30%静置24h,滤过;滤液继续加乙醇至80%静置24h,滤过,得沉淀多糖粗提物,80℃常压烘干。粉碎至80目,加入乳糖、甘露醇。提取物∶乳糖∶甘露醇为3∶1∶1,湿法制粒压片(1g相当于11.2g生药,成人量2g/d)。Wistar大鼠40只,随机分为5组,每组8只。除正常对照组外,余各组按参考文献复制衰老模型,即每只动物每日皮下按120mg/kg的剂量注射D-半乳糖溶液0.5ml,连续注射7w。从造模第二周开始,正常对照组与衰老模型组给予同体积生理盐水(NS),维生素E组给予维生素E混悬液25mg·kg-1·d-1灌胃,其余两组分别灌服相应锁阳多糖咀嚼片0.25g·kg-1·d-1、水提物咀嚼片1.00g·kg-1·d-1,均灌服连续6w。6w后,各组大鼠称重处死,解剖取脾脏,用NS洗净,吸干称重,计算脾脏指数。在超净工作台上取1/2脾脏组织剪碎,经300目筛网过滤,用含双抗(青霉素+链霉素)的PBS液洗3次,并用1640培养液(含10%小牛血清、青霉素、链霉素、丙酮酸钠、β-巯基乙醇)调整细胞浓度为1×106个/ml。加入96孔培养板中,每孔0.1ml,各组分装复孔作为平行样,依次加浓度为100μg/ml、50μlConA液(相当于5μg/ml),并设对照孔(不加ConA),置5%CO2,37℃培养72h。培养结束前4h,加入MTT(5g/L)50μl/孔,继续培养4h后,每孔加入0.1ml二甲基亚酚,过夜完全溶解紫色结晶后,每孔用酶联免疫检测仪,以570nm波长测定光密度值(OD值)。各孔OD值减去对照孔OD值代表淋巴细胞的增殖能力。将上述称重后的1/2脾脏经福尔马林固定后,石蜡包埋,切片,HE染色,光镜下观察。6w后大鼠股动脉取血分离血清,用黄嘌呤氧化酶法测定SOD水平;硫代巴比妥酸法(TBA)测定MDA含量,硝酸盐还原酶法测定NO含量,具体步骤按试剂盒说明书进行。所有数据用ˉx±s表示。各组进行单因素方差分析处理后应用LSD-t检验进行两两比较,采用SPSS13.0统计软件处理。2结果2.1锁阳对老鼠脾脏指数的影响表1结果显示,衰老模型组脾脏指数比正常对照组下降(P<0.05);各药物组给药后的脾脏指数比衰老模型组升高(P<0.05)。2.2两组化能力比较表2结果显示,衰老模型组大鼠脾淋巴细胞转化能力比正常对照组显著下降(P<0.05);各药物组给药后大鼠脾脏淋巴细胞转化能力比衰老模型组显著升高(P<0.05)。2.3小、红髓扩大且脾收入量的变化正常对照组脾小结大小均匀,无明显异常;衰老模型组脾脏白髓明显缩小、红髓扩大并充血,同时脾小结淋巴细胞数目明显减少;各治疗组虽脾小结大小不一,但白髓区明显扩大,红髓血管扩张、充血,脾中央小动脉周围淋巴鞘明显扩大,细胞增多,密度增大,衰老病理损伤明显改善。2.4不同模型大鼠血sod、mda、no含量的比较表3结果显示,衰老模型大鼠血清SOD水平较正常对照组明显下降、MDA、NO含量明显增多(P<0.05);给予锁阳提取物后,血SOD水平较衰老模型大鼠明显升高(P<0.05),MDA、NO含量较衰老模型大鼠明显降低(P<0.05);且锁阳多糖组在改善自由基水平方面优于锁阳水提物组。3衰老模型检测中医学认为脏腑虚损为衰老的主要机制之一,其中又以肾虚致衰、脾虚致衰、脾肾虚损致衰的论点为各种学说的中心。锁阳具有补肾、助阳、益精等功能,现代临床及药理研究均表明锁阳具有调节免疫内分泌、抗衰老、改善性功能等多种生理活性。基于以往研究成果本课题组研制并开发的锁阳咀嚼片,具有以下优势:在有效成分的提取方面,分别提取锁阳多糖以及水提醇沉物作为主要研究成分,通过比较研究,筛选出更为有效的药效成分;在剂型选用方面,选用咀嚼片,该剂型可明显提高药物的生物利用度,具有稳定性好,适用人群范围广等优势。本研究选用D-半乳糖诱导大鼠亚急性衰老模型,结果表明衰老模型组大鼠脾脏指数、大鼠脾淋巴细胞对ConA刺激的增殖活性明显下降,脾脏发生明显病理损伤,血清中SOD活性明显下降,MDA及NO含量增多,与文献报道结果一致,提示衰老模型复制成功。脾脏是人类最大的外周免疫器官,是T、B淋巴细胞主要的定居场所,老年脾脏萎缩也必然会影响机体的体液及细胞免疫功能。老年人的免疫器官的衰退,最突出的表现是T、B细胞的功能减退,对非特异性有丝分裂原PHA、ConA及外来抗原反应性降低,导致免疫功能下降,易发生感染。同时,随着年龄的增长,机体抗氧化酶的活性不断下降,机体中过量氧自由基迅速与核酸、蛋白质、氨基酸、脂质等反应,导致碱基缺失,氢键破坏,蛋白质交联,多肽链断裂,发生脂质过氧化反应,生成大量MDA,加快细胞中DNA、蛋白质、脂膜等损伤,促进细胞凋亡发生,大量组织细胞凋亡的结果使机体老化。NO作为机体内广泛存在并具有重要作用的信息分子,在衰老过程中其合成发生改变,当NO合成不足时会导致其介导的生理过程无法实现,而过量的NO则会通过与蛋白质、脂肪、核酸生物分子的相互作用损伤机体组织,破坏细胞和机体稳态,对机体产生毒性。有报道衰老与NO过量合成产生细胞毒作用有密切关系。本研究表明锁阳可明显提高衰老模型大鼠脾脏指数、脾脏淋巴细胞转化能力,显著改善脾脏病理形态变化,提高血清SOD活性,降低MDA、NO异常升高。提示锁阳可能通过提高机体免疫