6-姜酚诱导k562细胞凋亡的差异表达蛋白的研究

6-姜酚诱导k562细胞凋亡的差异表达蛋白的研究

根据现代药理学研究，姜酚具有抗炎、抗溃疡、抗组胺等药理活性，并报告了许多关于肿瘤作用的报告。本课题组前期研究发现6-姜酚能显著抑制慢性粒细胞白血病K562细胞增殖,诱导细胞凋亡,但其确切作用机制尚不明确。目前关于姜酚抗肿瘤作用机制的研究仅限于个别基因或蛋白质,在蛋白质组学水平上的报道很少。自1995年澳大利亚学者首先提出蛋白质组(Proteome)的概念,近年蛋白质组学(proteomics)技术日益用于寻找筛选抗肿瘤药物靶点的研究,可动态、整体、定量地从整体水平研究蛋白质组成及其变化规律,比较分析药物作用肿瘤细胞前后的蛋白质表达谱差异,确定药物作用靶位。本研究比较了6-姜酚作用K562细胞后差异蛋白质谱变化,试图从蛋白组水平探讨其抗白血病的机制。1材料和机器1.1细胞植物K562细胞,由本实验室保存。1.2蛋白质药物活性测试6-姜酚参照文献制成高纯度簇状姜酚结晶(经质谱、核磁共振氢谱、紫外光谱、红外光谱等证实为姜酚),用分析纯DMSO溶解配制成5.5μg/mL溶液备用;RPMI-1640培养液(Gibco);小牛血清(杭州四季青公司);固相pH梯度干胶条、IPG缓冲液、覆盖液、溴酚蓝(AmershamBiosciences),BSA、DNaseⅠ(GE),蛋白酶抑制剂PMSF、低熔点琼脂糖、过硫酸胺、TEMED、DMSO(Sigma),G-250染色液(Bio-Rad),胰蛋白酶(Promega)。其他试剂均为国产分析纯。1.3仪器、检测方法IPGphor等电聚焦仪;EttanDALT垂直电泳槽;ImageScanner扫描仪;核酸蛋白测定仪(GE);PowerPAC1000电泳仪;4800MALDI-TOF/TOF串联时间飞行质谱(ABI);MILLIPORE纯水系统(MilliPore);蛋白核酸干燥仪(德国Thermo)及流式细胞仪(CoulterElite)。1.4分析方法及数据库查询软件Labsean扫描软件、DataExplorer质谱分析软件(美国AppliedBiosystem);ImageMaster2DPlatinum双向凝胶图谱分析软件(瑞典AmershamBiosciences);MascotMS/MS数据库查询软件(英国Matrixscience);PDQusst凝胶图像分析软件(Bio-Rad)。2方法2.1rpmi-1330细胞培养K562细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液,于37℃、5%CO2常规传代培养。取对数生长期、台盼蓝拒染>95%的细胞进行实验。2.2增殖抑制率测定3×104/mLK562细胞接种于96孔培养板,终体积200μL/孔,设3复孔,6-姜酚设5个浓度(2.5、5、10、15、20μg/mL)。37℃、5%CO2培养48、72h后,每孔加入10μLCCK-8试剂,孵育1h,酶标仪测光密度D(λ)值(测定波长450nm,参比波长655nm),计算各组增殖抑制率。每次实验重复3次,取其均值。增殖抑制率(%)=1−D(λ)实验组D(λ)对照组×100%(%)=1-D(λ)实验组D(λ)对照组×100%2.36细胞总蛋白的测定6-姜酚半数抑制量处理K562细胞48h,收集细胞,加细胞裂解液吹打混匀,4℃振荡30min,4℃、13200r/min离心30min,取上清即为细胞总蛋白。按Bradford法测定蛋白质浓度。-70℃保存备用。2.4sds-东南角电泳第一向采用固相pH梯度等电聚焦电泳。将200μg蛋白质样品与样品水化液充分混匀加入水化槽中,总量250μL。按以下程序进行等点聚焦,总时间约为22h(30V,12h;500V,1h;1000V,1h;8000V,8h;2000V,10h)。双向电泳采用SDS。将平衡结束的胶条置于SDS凝胶上端,4℃、10mA,电泳30min后电流增至20mA,电泳至溴酚蓝前沿距凝胶底部115mm处停止。Step1,15mA/胶条,15min;Step2,30mA/胶条,电泳约4h。2.5染色将凝胶转移到染色盒里固定,采用快速银染法染色。2.6点的匹配点、点的编码将染色后的2-DE图谱扫描入计算机,用ImageMaster2DPlatinum进行图像分析。通过检测胶上点的位置、大小、点的灰度值,将胶的点数字化,分析胶间的匹配点,将各分析胶上相同位置上点的差异以倍数的形式显示出来。将3次重复加姜酚作用前后的K562细胞共6张银染凝胶图谱用图像分析软件ImageMaster2DPlatinum进行成组比较,选择差异在2倍以上且重复性好的蛋白质点作为候选差异表达蛋白质点进行质谱分析。2.7肽指纹图谱的鉴定切下初步筛选出的差异蛋白质斑点,用4800MALDITOF/TOF串联飞行时间质谱仪进行肽指纹图谱鉴定。从GPSExplorer软件(V3.6,AppliedBiosystems)得到MS和MS/MS的数据,搜索IPI数据库搜库。得分(MS和MS/MS联合)超过65被认为超过阈值(P≤0.05),为可信的鉴定结果。2.8差异是通过氨基酸功能分类和氨基酸相互作用网络图确定的将差异表达蛋白质通过PANTHER系统功能分类,用STRING(基因/蛋白质相互作用检索工具)绘制蛋白质相互作用网络图。2.9统计处理实验结果以SPSS11.0软件分析,数据用x¯±sx¯±s表示,两组间比较用t检验,多组间比较用多因素方差分析。3环境生物活性成分的检测表观和蛋白点分析3.16-姜酚对K562细胞增殖活性的影响不同浓度的姜酚在不同时间点对K562细胞均有显著的增殖抑制效果,且呈剂量、时间依赖关系,其中72h的增殖抑制效果较48h强(图1)。0.5%DMSO对照组在48、72h的增殖抑制率分别为(2.7±0.65)%、(4.5±0.56)%,与空白对照组比较无显著性差异(P﹥0.05)。不同浓度的姜酚处理组与DMSO组比较差异显著(P﹤0.01)。3.26-姜酚处理前后K562细胞的双向电泳结果结果如图2所示,3次双向凝胶电泳分离,银染显色后得到2种pH梯度背景清晰、分辨率高、重复性好的2-DE各3块。用ImageMaster2DPlatinum图像分析软件分析。进行蛋白质斑点检测。在每块胶上选择相同位置且显著的点作为标志点(landmark),根据标志点位置,对图像进行匹配分析。选择差异倍数大于2倍以上的蛋白质点。3.3质谱分析结果取差异表达的蛋白质点,通过胶内原位酶解进行MALDI-TOF-MS肽指纹图测定。结合双向凝胶电泳相应蛋白质点的表观等电点、相对分子质量、匹配片段的多少以及氨基酸序列的覆盖率进行鉴定,共鉴定出42个差异表达蛋白,选择其中35个非重复性差异蛋白分析,结果表明19个高表达,16个低表达,涉及氧化应激反应蛋白、细胞周期调节相关蛋白及细胞凋亡信号转导通路蛋白。有意义的上调及下调的差异蛋白见表1～3。其中下调表达的AHSA1(HSP90ATP同工酶的激活剂)及SAE1(泛素类家族成员)的质谱检测结果见图3、4。4姜酚对k562细胞的作用机制在于其提高1986年,Hanash等开始应用2-DE技术进行白血病蛋白质组研究,证实急淋儿童外周血或者骨髓的原始淋巴细胞分化有关的多肽(小分子蛋白质片段)特性;近年来国内学者也开始将蛋白组学技术用于白血病研究。Cui等应用2-DE联合MALDI-TOF-MS与ESI-MS/MS分析急性白血病骨髓,发现不同FAB分型的白血病有各自明确的蛋白质表达特性。田帅等发现诱导缓解治疗前的白血病细胞差异蛋白质表达水平与其预后有关,白血病复发时骨髓细胞蛋白质有变化。但目前在蛋白质水平探讨抗白血病药物作用机制的研究刚起步,少数研究主要围绕维甲酸耐药细胞和敏感细胞的差异蛋白表达,以及维甲酸诱导HL-60细胞向粒系和单核系分化时的蛋白组差异表达,其它抗白血病药物的报道尚少。生姜是植物姜(ZingiberofficinaleRoscoe)的新鲜根茎,姜酚从生姜中提取,是生姜的主要生物活性成分,因其来源广泛、价廉、安全而备受关注。已有体外实验及动物实验研究显示其具有抗肿瘤活性,如皮肤癌、消化道肿瘤、泌尿系肿瘤、乳腺癌等,也有报道可抑制人白血病HL-60细胞的DNA合成和活性。本实验显示不同浓度的姜酚在不同时间点对K562细胞均有显著的增殖抑制效果,且呈剂量、时间依赖关系;6-姜酚作用K562细胞后可引起35种蛋白差异非重复表达,其中19个高表达,16个低表达,如AHSA1(Activatorof90kDaheatshockproteinATPasehomolog1)即热休克蛋白90(HSP90)ATP酶同系物的激活剂、蛋白质生物合成与代谢蛋白,包括真核翻译起始因子3G、转录延长因子1-γ、tRNA合成酶及泛素化类活化酶(EIA)等,蛋白丙酮酸激酶,琥珀酸脱氢酶,NADH-泛醌氧化还原酶等,功能涉及氧化应激、调节细胞周期及细胞凋亡信号转导、蛋白质生物合成及糖代谢等重要蛋白及蛋白酶,提示上述多个蛋白可能在多个环节或途径促使K562细胞对姜酚敏感,从而影响白血病细胞凋亡或存活;这也许正是6-姜酚抗白血病的多靶点作用机制。其中低表达蛋白中,AHSA1属于AHA1家族,是一种ATP依赖性的分子伴侣,包含在突变,稳定/退化过程中,具有致廇功能,主要功能是激活HSP90ATP酶活性,HSP90为线粒体分子伴侣(molecularchaperone),帮助蛋白跨越内膜及维持蛋白的特定构象,短暂参与蛋白质合成后非共价折叠,组装或非组装其他的多肽或RNA分子,参与运输或加工处理低聚物,参与应激状态引起的蛋白分子的重新组装和重新折叠及RNA分子的变性,参与蛋白的成熟、稳定、降解及其功能发挥。ATP水解可驱动HSP90形成多肽链复合物从而发挥作用。有研究发现抑制AHA1表达可导致客户蛋白(clientproteins)表达缺失,增强HSP90对HSP90抑制剂的敏感性。本课题组前期实验发现姜酚降低K562细胞线粒体跨膜电位(ΔΨm),诱导细胞早期凋亡。本实验显示姜酚下调K562细胞内AHSA1表达,提示其作用靶点可能为通过线粒体途径抑制AHSA1,从而抑制白血病细胞生存。低表达的另一蛋白SAE1是泛素相关小修饰蛋白(苏素)(smallubiquitin-relatedmodifier,SUMO)激活酶亚单位1(SUMO-activatingenzymesubunit1)。SUMO属于泛素类家族成员,通过一系列酶降解步骤:涉及SAE1而激活;涉及SAE2(Ubc9,ubiquitin-conjugatingenzyme9)而结合;通过Ubc9和及E3蛋白连接酶的结合而修饰底物。SUMO异构体的稳定与其两个亚单位SAE1及SAE2密切相关,一些外来毒性蛋白如腺病毒Gam1对SAE2的效应是由于SAE1蛋白酶体降解使SAE2活性不稳定而加速泛素化及降解。姜酚下调K562细胞内SAE1表达,提示姜酚可通过泛素-蛋白酶体途径(ubiquitinpro