酵母双杂交系统的分子间相互作用及调控机制

酵母双杂交系统的分子间相互作用及调控机制

许多生物过程由蛋白质和蛋白质以及dna和蛋白质之间的相互作用实现。对这些大分子之间相互作用的生物化学和遗传分析有助于澄清生物过程中的分子机制。酵母单杂交,双杂交及三杂交系统技术的出现及发展极大地推动了这方面研究的进展,成为分析鉴定蛋白-蛋白,DNA-蛋白相互作用及调控的强有力工具,并显示出广阔的应用前景。1酵母双杂交系统的构建酵母单杂交系统主要用来分离鉴定与特异DNA序列结合作用的蛋白质并同时获得其编码基因。酵母单、双杂交系统均利用了许多真核生物转录激活因子(transcriptionactivator),如GAL4的独特结构特点,即自身含有功能上必须的两个独立结构域-DNA结合域与转录激活域。在酵母单杂交系统中,与转录激活域融合的结合蛋白与靶DNA序列的相互作用可以同样激活报道基因的表达,而酵母双杂交系统中则利用此特点可以构建两种杂合蛋白,一种为已知蛋白X与DNA结合域融合的杂合蛋白,一种为未知蛋白Y与转录激活域间的融合蛋白。当编码此两种相应杂合蛋白的表达质粒导入酵母后,如果蛋白X和Y之间存在相互作用,则表达产生的两种杂合蛋白会由于这种相互作用使其中的转录激活域进入其正常作用的启动子(UASG)位点而激活报道基因的表达(如lacZ)。其作用模式简图见图1。酵母双杂交系统的建立已使人们成功地测定了许多在生物学过程中可能起重要作用的蛋白与蛋白间的相互作用,例如原癌基因编码的蛋白与各种靶蛋白间的相互作用。同时,双杂交系统还可以被用来确定参与蛋白-蛋白相互作用中的特异性结构域。此外,双杂交系统还被用来设计寻找能与细菌或病毒致病性蛋白相互作用而具有一定医疗价值的蛋白多肽。应用双杂交系统的另一个优点是在从转录激活域融合蛋白库中找出与已知蛋白相互作用的靶蛋白后,并可以同时获得该作用蛋白的编码基因,而不需通过制备纯化蛋白或抗体等繁琐生化手段来建立这种相互作用关系。近年来,基于各种具体情况人们对酵母双杂交系统作了各种修饰改进,如以lexADNA结合域代替GAL4结合域;以活性较弱的转录激活域代替GAL4激活域从而避免假阳性及强激活域对细胞带来的毒害作用。2ura3基因产物的扩增蛋白-蛋白间的相互作用一旦被确定,一般还要进行大量的实验来研究这种相互作用的结构功能关系及其调控机制。对相互作用双方中发生的能消除此种相互作用的突变分析不仅能确定参与作用的结构成分,而且获得的突变体也是进行体内功能分析的有用遗传工具。酵母反向杂交系统的出现使得两步甚至一步检测分离能解除已知相互作用的突变或反式作用因子成为可能。反向杂交系统的关键在于系统中引进的报道基因为酵母URA3基因,它被置于含有一定数目GAL4结合位点的启动子的严紧控制下。URA3基因产物既为尿嘧啶生物合成所必须同时又能催化5-FOAO转化生成一细胞毒性化合物。因此,当两种蛋白发生正常的相互作用时,由于激活了URA3基因的表达而使细胞不能在含有5-FOA的完全培养基上生长;而当作用双方发生突变消除或减弱了这种相互作用后,就可以在5-FOA平坂上得到抗性生长菌落。通过实验可以确定检测引起URA3表达极小变化的较弱突变所需的最少GAL4结合位点数目及最低5-FOA浓度,从而最大限度地提高检测系统的灵敏度。Vidal等在此基础上结合进一步的正向选择,确定了转录因子E2F-1中另一个新的参与与DP1结合的区域。如果在上述含有依赖于GAL4结合位点的URA3负选择报道基因的菌株中再引入一个依赖于LexA结合位点的His4或LacZ正选择报道基因,就可以一步筛选出目的蛋白中发生的能解除与一个靶蛋白相互作用而仍保持与另一个靶蛋白相互作用的突变或反式调节因子。这一系统尤其可以用于分析复杂信号传导途径中具有多个作用靶点的蛋白,从而为阐明细胞中各种复杂生物学过程之间的相互关系提供重要信息。总之,由于酵母反向杂交系统的独特性能使得人们能从极度复杂的cDNA库或肽库中筛选能解离特异性蛋白相互作用的反式调节因子(可能通过竞争结合、对底物蛋白的修饰等发挥作用),而且通过筛选能特异性解除与疾病相关的异常蛋白相互作用的效应肽分子,系统本身还可以用于开发有药用价值的生物制品。3基于生物活性的三杂交分析生物学中常常利用小的有机配体来研究阐明许多生物学过程,如信号传导和细胞分化调控等的发生机制,配体-受体间的相互作用也是医药工业中药物设计的基础。一旦某一受体被证明与某一疾病相关,寻找能与此受体结合并调节其功能的配体小分子就显得极为重要,因为这些配体分子可以作为被开发药物的首选目标。在酵母双杂交系统的基础上,Licitra等结合合成有机化学生产的异源杂交配体,建立了一种体内分析配体受体相互作用的三杂交系统。这种系统不仅可以用来迅速分离鉴定与已知配体分子相互作用的受体编码cDNA基因,而且还能筛选已知受体的未知配体分子。其作用模式见图2。利用此种方法,Licitra等从JurkatcDNA库中筛选到了免疫抑制剂FK506的受体编码cDNA片段。此外,与酵母双杂交系统或噬菌体呈现系统所要求的多肽配体库相比,三杂交系统所能筛选的配体类型范围要广泛得多,它可以包括由D-氨基酸组成的多肽配体到任何合成的有机化合物配体。同时,与常规的体外生化筛选方法相比,经过酵母三杂交系统筛选得到的配体分子,它们的细胞通透性及胞内稳定性也同时得到了确认,从而大大提高了筛选效率。当然,对影响其相互作用的许多因素如产生阳性信号所需的配体受体最低亲和力、细胞对配体分子的通透性等还有待进一步研究。D.J.SenGupea等人根据同样的原理建立了一种在酵母中检测RNA-蛋白特异性相互作用的三杂交系统。与Licitra等的三杂交系统使用杂合配体分子不同的是,D.J.SenGupea等的三杂交系统使用了一种杂合的RNA分子来联接重建转录激活功能。此系统的建立对研究RNA加工、翻译、mRNA稳定性、RNA病毒的包装及感染性等许多生物学过程中RNA-蛋白间功能性相互作用是极为有利的。4蛋白质关联图和相互作用的生物功能相关性随着生物化学及遗传学技