《河南师范大学-细胞生物学-第三章》文档阅读

第三章细胞生物学研究方法内容提要细胞形态结构的观察方法细胞组分的分析方法细胞培养、细胞工程和显微操作技术细胞生物学研究的模式生物第一节细胞形态结构的观察方法显微镜的出现，结合细胞化学的方法，尤其是免疫细胞化学技术，细胞整体形态、细胞的结构、细胞中的分子甚至原子都得以揭示。Figure

3-1.

Resolving

power.

Sizeof

cells

and

their

components

drawnon

a

logarithmic

scale,

indicatingthe

range

of

objects

that

can

bereadily

resolved

by

the

naked

eyeand

in

the

light

and

electronmicroscopes.一、光学显微镜技术：光学显微镜技术是细胞生物学研究常用手段之一。光学显微镜构成：光学放大系统（包括物镜和目镜）照明系统支撑系统1

复式光学显微镜技术显微镜最为重要的性能参数是分辨率（指区分开两个质点间的最小距离），而非放大倍数。性能参数：分辨率(D值)越小，分辨率越高（D值与光源波长λ成正比，与介质折射率N成反比；所以波长越短，分辨率越高，介质折射率越大，分辨率越高）0.61λN

·

sin（α/2）D=以波长最短的可见光（400-700nm）的蓝光（450nm）为光源，空气为折射介质，光学显微镜最大分辨率0.3um；以油为折射介质，可以达到0.2um；如果以紫外线（200-300nm）作为光源，分辨率可达到0.1um。光镜下可以看到的结构包括细菌、线粒体（0.5um大小，是光镜下能清晰可见的最小物体）、中心体、核仁等，称为显微结构。组织切片的制备－包埋－切片－脱蜡－复水－染色－脱水－透固定的目的是使细胞及其成分锁定在原有的位置，常用的有乙醇、甲醇、甲醛、戊二醛等。常用的染色剂有苏木精、伊红、孔雀绿、苏丹黑、考马斯亮蓝等，它们对细胞某一特殊的亚细胞成分有特异的亲和性。切片厚度1-10um使用明视野显微镜（bright-fieldmicroscope）很难观察到小的、未经染色的样品，如：活细胞。相差显微镜（phase-contrastmicroscope）则易于观察高透明的物体。2相差和微分干涉显微镜技术相差显微镜：利用光的衍射现象，通过增加相差版和环形光阑，将肉眼不能察觉的相位差转变成振幅差，从而表现为肉眼可见的明暗区别。样品不需要染色，优点是能观察无色、透明的活细胞中的结构。利用的是不同成分、部分的光衍射系数不同的特点。细胞培养中使用的倒置相差显微镜，更便于观察培养物中的活细胞。微分干涉显微镜：利用光的干涉现象，以平面偏振光为光源，适合观察活细胞中较大的细胞器。与录像装置结合，可以观察和记录活细胞中颗粒及细胞器的运动，例如：录像增差显微镜技术（video-enhance

contrast

microscopy）就是将计算机辅助系统应用于微分干涉显微镜，可以观察微管上颗粒的运动。Figure

3-11.Four

types

of

light

microscopy.(A)The

image

of

afibroblast

in

culture

obtained

by

the

simple

transmission

of

ligh

the

cell,a

technique

known

as

bright-field

microscopy.(B)phase

contrast

microscopy,(C)Nomarski

differential-interference-co

microscopy,and

(D)dark-field

microscopy（暗视野显微镜）.Video-enhance(contrast)

microscopy·Observing

living

specimens;·Greatly

increasethecontrast

of

an

image

so

thatvery

small

objects

become

visible.3荧光显微镜技术

荧光显微镜的原理是利用一定波长的紫外线作为光源来激发标本中存在的荧光物质，使其发出不同颜色的光而成像。是目前光镜水平对蛋白等大分子定性定位研究的重要工具。

包括两套滤光片，激发光滤片（只让能激发特殊荧光染料的波长通过）和阻断滤片（只允许荧光通过），在黑暗的背景上，发出荧光的样品很容易被观察到。有些生物体中的天然物质受到紫外线照射能够发出荧光，有些成分则不发光或荧光微弱，需要特定的荧光染料染色显示。常用荧光染料：DAPI(联脒基苯吲哚)和碘化丙锭可以染DNA；吖啶橙可以染DNA和RNA；荧光黄（fluorescein）受到蓝光激发产生强烈的绿色荧光；罗丹明（rhodamine）受到黄绿色光激发可产生深红色荧光，分别与抗体耦联，可以观察两种不同抗原分子在同一细胞内的分布。Figure

3-9.

Fluorescence

microscopy.

Micrographs

of

a

portion

of

the

of

an

early

Drosophila

embryo

in

which

the

microtubules

have

been

labeled

with

an

antibody

coupled

to

fluorescein

(left

panel)

and

the

actin

filaments

have

been

la

with

an

antibody

coupled

to

rhodamine

(middle

panel).

In

addition,

the

chromosome

have

been

labeled

with

a

third

dye

that

fluoresces

only

when

it

binds

to

DNA

(right

panel).

At

this

stage,

all

the

nuclei

of

the

embryo

share

a

common

cytoplasm,

and

tare

in

the

metaphase

stage

of

mitosis.

The

three

micrographs

were

taken

of

the

sam

region

of

a

fixed

embryo

using

three

different

filter

sets

in

the

fluorescence

mic在细胞生物学与分子生物学领域中，来自水母的绿色荧光蛋白基因常被用作为一个报告基因

(reporter

gene)。将GFP基因与待测基因融合，在细胞内表达，可

以通过荧光显微镜观察蛋白在活细胞内动态变化。日本科学家下村修、美国科学家马丁·沙尔菲和美籍华裔科学家钱永健因在发现和研究绿色荧光蛋白方面做出贡献而获得2008年诺贝尔化学奖。4激光扫描共焦显微镜技术20世纪50年代后期发明，多技术的集合。物镜和聚光镜同时聚焦到同一点上（共焦点），可以自动改变观察的焦平面，通过“光学切片”获得一系列细胞不同切面上的图像，经叠加后

重构样品的三维结构。比普通荧光显微镜成像更清晰，分辨率更高。在研究亚细胞结构与组分的定位及动态变化应用广泛。Figure

3-8.

Comparison

of

conventional

and

confocal

fluorescemicroscopy.

These

two

micrographs

are

of

the

same

intact

gastrula-stage

Drosembryo

that

has

been

stained

with

a

fluorescent

probe

for

actin

filaments.

Theconventional,

unprocessed

image

(A)

is

blurred

by

the

presence

of

fluorescentstructures

above

and

below

the

plane

of

focus.

In

the

confocal

image

(B),

this

outfocus

information

is

removed,

which

results

in

a

crisp

optical

section

of

the

cellembryo.5荧光共振能量转移技术检测活细胞中生物大分子纳米级距离和纳米级距离变化的有利工具，可以检测两个蛋白质分子是否存在直接的相互作用。方法是将两种蛋白分别与CFP（

cyanfluorescentprotein）,YFP（

yellowfluorescent

protein

）融合表达，通过检测

CFP荧光强度的损失量确定两个蛋白是否相互作用。如果发生能量转移，说明两个蛋白的距离在

10nm的范围内，一般可以认定有相互作用。6荧光漂白恢复技术利用荧光分子的耦联，检测活细胞表面或内部的分子运动以及在各种结构上分子动态变化率的大小。能够获得蛋白质运动的定性结果，还可以得到扩散常数、蛋白移动率等定量信息。图3-10二、电子显微镜技术分辨率更高，1932年Ruska制成。与光镜的基本区别：构成上：光源为电子束（小于0.1nm），使用电磁透镜，镜筒中要求高真空，图像通过荧光屏观察。分辨率上：最高0.2nm，只能在电子显微镜下观察到的结构称为亚显微结构（超微结构）。透射电子显微镜（transmission

electron

microscope,TEM）利用透过样品的电子形成图像，在观察细胞内部结构方面应用广泛。扫描电子显微镜（scanning

electron

microscope,SEM）利用样品表面反弹的电子成像，主要用于观察物体的表面结构。1透射电子显微镜放大倍数在1000-250000倍之间，分辨极限为3~5埃。TEM电镜制样技术：(1)超薄切片技术:厚度40-50nm固定—包埋—切片—染色Figure

3-19.

Diagram

of

the

copper

grid

used

to

support

the

thisections

of

a

specimen

in

the

transmission

electron

microscopThin

sectionsFigure

3-20.

Electron

micrograph

of

a

root-tip

cell

stained

wiosmium

and

other

heavy

metal

ions.

The

cell

wall,

nucleus,

vacuoles,mitochondria,

endoplasmic

reticulum,

Golgi

apparatus,

and

ribosomes

are

easily

sFigure3-21.

Electron

micrograph

of

a

cell

showing

the

location

of

a

particu

enzyme

(nucleotide

diphosphatase)

in

the

Golgi

apparatus.

A

thin

section

of

twas

incubated

with

a

substrate

that

formed

an

electron-dense

precipitate

upon

rea

with

the

enzymeFigure

3-63.

Immunogold

electron

microscopy.

Electron

micrographsinsulin-secreting

cell

in

which

the

insulin

molecules

have

been

labeled

with

antiantibodies

bound

to

tiny

colloidal

gold

spheres.

Most

of

the

insulin

is

stored

indense

cores

of

secretory

vesicles;

in

addition,

some

cores

are

being

degraded

inlysosomes.(2)冷冻超薄切片技术可以保存可溶性物质和生物大分子的活性（尤其是酶），能够在分子水平上研究细胞的超薄结构。样品放置在液态丙烷（-42℃）或液氦（-273℃）冷却的金属块上，快速冷冻，冰晶没有时间生长到明显破坏细胞结构的程度。

冷冻切片制备快速，在临床上用于切除组织的恶性或良性的鉴定。(3)冷冻蚀刻电镜技术通过样品迅速冷冻和低温下断裂，观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构。样品可不经包埋和固定处理。Figure.

Freeze-fracture

electron

micrograph

of

the

thylakoid

membranes

frchloroplast

of

a

plantcell.

These

membranes,

which

carry

out

photosynthesis,stacked

up

in

multiple

layers.

The

largest

particles

seen

in

the

membrane

are

thecomplete

photosystem

II-a

complex

of

multiple

proteins.Freeze-Fracture

and

Freeze-Etch

Electron

MicroscopyFigure

3-22.

Three-dimensional

reconstruction

from

serial

seSingle

thin

sections

sometimes

give

misleading

impressions.

In

thexample

most

sections

through

a

cell

containing

a

branchedmitochondrion

will

appear

to

contain

two

or

three

separate

mitochSections

4

and

7,

moreover,

might

be

interpreted

as

showing

a

mitochondrion

in

the

process

of

dividing.

The

true

three-dimensionalhowever,

can

be

reconstructed

from

serial

sections.系列切片的三维重构2

扫描电子显微镜：主要观察样品表面的形貌特征。制样不需要切片和染色。

为防止样品在干燥中变形，常用CO2临界点干燥法，样品观察前要用镀金（一般是金或金-钯合金）的方法使标本导电。

观察样品的大小范围从病毒到昆虫的头部，一般放大为15-150000倍，分辨率3nm。Figure

3-23.

Scanning

electron

microscopy.

Scanning

electronmicrograph

of

the

stereocilia

projecting

from

a

hair

cell

in

the

iof

a

bullfrog

(A).

For

comparison,

the

same

structure

is

shown

bydifferential-interference-contrast

light

microscopy

(B)

and

by

tsection

electron

microscopy

(C).Figure

3-32.

Cells

in

culture.

Scanning

electron

micrograph

offibroblasts

growing

on

the

plastic

surface

of

a

tissue-culture

di3

扫描隧道显微镜（scanning

tunnel

microscpoe,STM）1986年获诺贝尔物理学奖，用于观察大分子、生物膜和病毒等，在纳米水平探索微观世界物质表面形貌。第二节细胞组分的分析方法细胞的分离技术：分离特定类型细胞亚细胞组分的分离技术：分离特定的细胞器或 组分细胞化学技术：显示鉴定大分子免疫细胞化学技术：特异蛋白的定位和定性原位杂交技术：特定核酸序列的定位和定性放射自显影技术：标记的生物大分子定位、定 量以及大分子动态示踪1细胞的分离技术：（1）流式细胞技术（flow

cytometer,FCM）：从组织中分选相对纯化细胞的方法，利用了荧光染料耦联的抗体标记细胞，通过FCM分选已标记和未标记的细胞，依据的是细胞内发荧光的

DNA含量不同，或者细胞表面荧光强度不同的特点。该技术广泛用于生物大分子的定量，细胞周期分析，细胞表面抗原、受体、染色体、核质比例、活细胞分类纯化等研究中。Figure

3-31.

A

fluorescence-activatcell

sorter.

When

a

cell

passes

througthe

laser

beam,

it

is

monitored

forfluorescence.

Droplets

containingsingle

cells

are

given

a

negative

orpositive

charge,

depending

on

whetherthe

cell

is

fluorescent

or

not.

Thedroplets

are

then

deflected

by

anelectric

field

into

collection

tubesaccording

to

their

charge.

Note

that

thcell

concentration

must

be

adjusted

sothat

most

droplets

contain

no

cells

andflow

to

a

waste

container

together

withany

cell

clumps.

The

same

apparatus

can

also

be

used

to

separatefluorescently

labeled

chromosomesfrom

one

another,

providing

valuablestarting

material

for

the

isolation

andmapping

of

genes.细胞淘洗（elutration）分离细胞：将细胞悬浮在淘洗分离室，细胞受到方向相反的两种力的作用，细胞在分离室中的沉积位置取决于沉降速率（与细胞大小、形状和密度有

关）。该方法的特点是分离速度快，同时可以分离不同周期和不同时相的细胞，可用于细胞周期、细胞增殖的研究。密度梯度离心法分离细胞：通过离心溶液形成密度梯度，以维持重力的稳定性来抑制对流。2亚细胞组分的分离技术：通常是用低渗、超声、研磨、匀浆或冻融的方法将细胞裂解，然后通过差速离心（differentialcentrifugation）使各种亚组分分开。不同组分的沉降率依据大小和形状的不同，以沉降系数(S)表示。通过密度梯度离心，可以将分子量小的核酸或蛋白质进一步分离纯化出来。例如：15N标记大肠

杆菌DNA，用氯化铯密度梯度离心的方法直接证明了DNA的半保留复制。The

technique

of

differential

centrifugatioS=(dx/dt)/2x=1

10-13sec.Step-by-step

procedure

for

the

purification

of

organelles

bdifferential

centrifugation.Figure

3-35.

Cell

fractionation

bycentrifugation.

Repeatedcentrifugation

at

progressively

higspeeds

will

fractionate

homogenatescells

into

their

components.

In

genethe

smaller

the

subcellular

componenthe

greater

is

the

centrifugal

forcerequired

to

sediment

it.

Typical

valfor

the

various

centrifugation

stepsreferred

to

in

the

figure

arelow

spee1,000

times

gravity

for

10

minutesmedium

speed:

20,000

times

gravityfor

20

minutes

high

speed:

80,000times

gravity

for

1

hour

very

highspeed:

150,000

times

gravity

for

3hours3细胞化学技术基于细胞内的某些成分可以和某些化学试剂相结合或呈特殊反应，在细胞内或表面形成有色沉淀物或结合物而显示细胞的结构和成分。√DNA的显示：Feulgen反应√多糖的显示：过碘酸雪夫（PAS）反应√脂类的显示：四氧化锇或苏丹III√酶的显示：通常将新鲜标本采用快速冷冻切片，尽可能保持其活性，然后将样品与相应底物进行共孵育。不同的酶有不同的显示方法。4免疫细胞化学技术在细胞水平研究特定的蛋白质的定位和定性，利用抗体的抗原特异性识别结合细胞内特定的蛋白质，再通过第二抗体的结合，使信号加强。最为敏感的增强信号的方法是用结合于第二抗体的酶作为标记分子。例如：荧光染料用于荧光显微镜、辣根过氧化物酶用于光镜或电镜、胶体金颗粒用于电镜、碱性磷酸酶用于生化检测。常用的有免疫荧光技术、免疫电镜技术，临床上的利用酶联免疫吸附试验（ELISA）的敏感性可以检测妊娠或各种感染。Figure

3-64.

Indirect

immunocytochemistry.

The

method

is

verysensitive

because

the

primary

antibody

is

itself

recognized

by

mamolecules

of

the

secondary

antibody.

The

secondary

antibody

iscovalently

coupled

to

a

marker

molecule

that

makes

it

readily

deteCommonly

used

marker

molecules

include

fluorescein

or

rhodaminedyes,

the

enzyme

horseradish

peroxidase

or

colloidal

gold

spheresthe

enzymes

alkaline

phosphatase

or

peroxidase.Figure

3-57.

Visualizing

intracellular

Ca2+

concentrations

using

a

fluorescindicator.

The

branching

tree

of

dendrites

of

the

Purkinje

cell

in

the

cerebellumreceives

more

than

100,000

synapses

from

other

neurons.

The

output

from

the

cell

iconveyed

along

the

single

axon

seen

leaving

the

cell

body

at

the

bottom

of

the

pictThis

image

of

the

intracellular

calcium

concentration

in

a

single

Purkinje

cell

wusing

a

low-light

camera

and

the

Ca2+-sensitive

fluorescent

indictor

fura-2.

Theconcentration

of

free

Ca2+

is

represented

by

different

colors,

red

being

the

higheblue

the

lowest.

(Courtesy

of

D.W.

Tank

et

al.)Figure

3-58.

Fluorescent

analogue

cytochemistry.

Fluorescencemicrograph

of

the

leading

edge

of

a

living

fibroblast

that

has

been

injected

withrhodamine-labeled

tubulin.

The

microtubules

throughout

the

cell

have

incorporatlabeled

tubulin

molecules.

Thus

individual

microtubules

can

be

detected

and

theidynamic

behavior

followed

using

computer-enhanced

imaging,

as

shown

here.Although

the

microtubules

appear

to

be

about

0.25

µm

thick,

this

is

an

optical

effthey

are,

in

reality,

only

one-tenththis

diameter.

(Courtesy

of

P.

Sammeh

and

G.Borisy.)5原位杂交技术原位杂交（in

situ

hybridization）是采用标记的核酸探针通过分子杂交确定特异核苷酸序列在染色体或细胞中位置的方法。首先在光镜水平上发展起来，又出现了荧光原位杂交（荧光素标记探针在荧光显微镜下观察）、电镜原位杂交（生物素等小分子标记探针，通过

检测抗生物素抗体相连的胶体金颗粒显示出来）。Figure

7-20.

In

situ

hybridization

for

RNA

localization

in

tisAutoradiograph

of

a

section

of

a

very

young

Drosophila

embryo

that

has

beensubjected

to

in

situ

hybridization

using

a

radioactive

DNA

probe

complementary

togene

involved

in

segment

development.

The

probe

has

hybridized

to

RNA

in

theembryo,

and

the

pattern

of

autoradiographic

silver

grains

reveals

that

the

RNA

mathe

gene

(ftz)

is

localized

in

alternating

stripes

across

the

embryo

that

are

threcells

wide.

At

this

stage

of

development

(cellular

blastoderm),

the

embryo

contaiabout

6000

cells.

(E.

Hafen

et

al,

Cell

37:833-841,

1984.)Tracing

and

Assaying

Molecules

Inside

CellsDistribution

of

OsAQP

mRNA

in

rice

leaves.a,

Negative

control

without

probe(

10×20);

b,

Hybrdization

withOsAQP

probe（the

enlargement

of

positive

sigal,

10×40）.

GC,guard

cells;

Me,

mesophyll

cells;

Ep,

epidermal

cell.6放射自显影技术利用放射性同位素的电离辐射对乳胶的感光作用，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究的细胞化学技术，能够对生物大分子进行动态研究和追踪。主要步骤：同位素标记的生物大分子前体的掺入和细胞内同位素所在位置的显示。3H-TdR研究DNA;3H-U研究RNA;35S标记的Met和Cys研究蛋白质将脉冲示踪实验和放射自显影术结合，对阐明细胞中的过程，例如分泌蛋白从内质网到细胞外的过程十分有效。脉冲示踪是将放射性物质以脉冲形式加入样品，经极短暂处理后，将其洗去，以非放射性分子代替。将染色体制作技术和放射自显影技术结合，可以观察染色体复制的动态变化、细胞周期的测定、鉴别早复制或晚复制的染色体。Figure

3-51.

Electron-microscopic

autoradiography.

The

resul

pulse-chase

experiment

in

which

pancreatic

beta

cells

were

fed

3H-

leucine

for

5

minutes

followed

by

excess

unlabeled

leucine

(the

ch

The

amino

acid

is

largely

incorporated

into

insulin,

which

is

dest

secretion.

After

a

10-minute

chase

the

labeled

protein

has

moved

fthe

rough

ER

to

the

Golgi

stacks

(A),

where

its

position

is

reveale

the

black

silver

grains

in

the

photographic

emulsion.

After

a

furt

minute

chase

the

labeled

protein

is

found

in

electron-dense

secre

granules

(B).(Courtesy

of

L.

Orci,

from

Diabetes

31:538-565)第三节细胞培养、细胞工程和显微操作技术一、细胞培养：属于生命科学研究的基本实验技术，涉及：原核细胞培养（细菌）真核单细胞培养（酵母）动物细胞培养植物细胞培养细胞培养的用途广泛，不仅可以研究细胞本身的生物学特性，还可改变培养条件、用特殊的理化因子和生物因子处理，观察细胞在形态、结构、行为、甚至基因的变化，从而得到细胞生长、分化、癌变、凋亡、衰老以及其他的病变规律。1动物细胞培养任何动物细胞的培养都需从机体获取细胞开始，因此体外培养细胞包括：（1）原代细胞（primary

culture

cell）从机体取出后立即培养的细胞，不同类型的细胞体外培养的难度差别很大。取材—分散细胞（酶消化处理和细胞筛滤过）---制备单细胞悬液--提供合适的培养环境（营养、温度、pH、血清、CO2等）--细胞贴壁—进行有丝分裂—形成细胞单层(2)传代细胞（subculture

cell）适应在体外培养条件下持续传代培养的细胞。包括两种类型：有限细胞系（finite

cell

line）：体外培养传代次数有限的细胞（约50代）。永生细胞系（infinite

cell

line）：传代中发生遗传突变，具有了癌细胞的特点，有可能无限制的传代培养下去。体外培养细胞可以分成贴壁型和悬浮型，一般不能保持体内原有的细胞形态。贴壁型有两种基本形态：成纤维样细胞和上皮样细胞；悬浮型则呈球形。2植物细胞培养单倍体细胞培养：花药离体培养：雄性生殖细胞---胚状体---单倍体植株愈伤组织培养：诱导愈伤组织---分化出芽和根---完整植株原生质体培养：植物体细胞---纤维素酶消化细胞壁---原生质体---培养和诱导分化---植株二、细胞工程：在细胞水平的生物工程，涉及的技术包括：细胞培养细胞分化的定向诱导细胞融合显微注射（1）细胞融合与细胞杂交技术：细胞融合：两个或多个细胞融合成一个双核或多核细胞，不经有性生殖过程而得到杂种细胞的方法。方法：病毒介导（灭活的仙台病毒）化学介导（聚乙二醇）电融合（高压电脉冲）基因型不同的细胞形成的融合细胞叫做异核融合细胞，在培养过程中会发生染色体丢失，例如：人鼠杂交细胞。细胞融合技术始于20世纪50年代末，60年代后期发明了只让杂种细胞存活并传代的技术。Figure

3-33.

The

production

of

hybrid

cells.

Human

cells

and

mouse

cells

are

futo

produce

heterocaryons,

which

eventually

form

hybrid

cells.

These

particular

hcells

are

useful

for

mapping

human

genes

on

specific

human

chromosomes

becausemost

of

the

human

chromosomes

are

quickly

lost

in

a

random

manner,

leaving

clonesthat

retain

only

one

or

a

few.

The

hybrid

cells

produced

by

fusing

other

types

of

coften

retain

most

of

their

chromosomes.（2）单克隆抗体技术：抗体：机体对抗原刺激应答所产生的免疫球蛋白，对相应的抗原有特异反应。是B淋巴细胞分化来的浆细胞合成并分泌的。类型：多克隆抗体：众多B细胞对一种抗原的不同抗原

决定簇应答而合成的多种免疫球蛋白，为不均质抗体。单克隆抗体：从单克隆杂交瘤细胞产生的抗体，为同一类或同一亚类的免疫球蛋白，其独特型和恒定区完全相同，具有高度的特异性。单克隆抗体技术是1975年Milstein和Kohler建立的，并于1984年获诺贝尔医学和生理学奖。原理：B淋巴细胞的免疫（对8-12周龄小鼠进行抗原注射）--分离免疫后小鼠的脾细胞—与小鼠骨髓瘤细胞融合—HAT培养液筛选杂交瘤细胞—具有稳定生长和抗体分泌功能的杂交瘤细胞的克隆化—收获单克隆抗体融合后的杂交瘤细胞具有亲本的特性，既可以分泌抗体，又可以在体外培养或移植到体内无限增殖。Figure

3-65.

Preparation

ofhybridomas

that

secretemonoclonal

antibodies

against

aparticular

antigen