肾盂内高压灌注动物模型的建立及其对肾单位结构的影响

肾盂内高压灌注动物模型的建立及其对肾单位结构的影响

近年来，腔镜技术在尿科领域迅速发展，并已成为治疗各种疾病的流行技术。尤其是仙女骨关节的形成逐渐取代了开放手术。膀胱内的腔镜手术需要注入清洁的液体，以保持手术领域的清晰性。然而，由于粘膜出血、管腔狭窄和大石头塌陷等原因，手术困难，手术时间延长，肾盂高压注射。肾盂内高压不但会造成肾单位的损害,更有甚者会造成肾破裂而死亡。我们建立肾盂内高压灌流的动物模型,观察肾盂内高压灌流对肾单位结构的影响,探讨输尿管镜及经皮肾镜时肾盂内灌流的安全压力。1对象和方法1.1肾私家车管输液管分离健康实验用猪4只(肾脏8个),体重31.55~45kg,平均37.71kg。氯胺酮10~20mg/kg,安定5~10mg/kg肌注后,阿托品0.5~1.0mg肌注解痉,气管插管后,5%戊巴比钠静脉维持。经腹部正中切口,于结肠旁沟处打开侧腹膜,分离肾脏和输尿管,于肾盂输尿管交界远端2cm处剪开输尿管,插入输液管至肾盂并固定,远端输尿管封闭,将充满液的输液管水平接至压力感受器测肾盂基础内压;再通过三通连接灌注泵,灌注生理盐水,至肾盂灌注压分别增高到6.67kPa、13.33kPa、20.00kPa、26.66kPa(50mmHg、100mmHg、150mmHg、200mmHg)保持10min后用18G穿刺针取肾上、中、下三处15mm肾组织固定后送检,作为第一阶段肾组织标本。第二阶段在第一阶段基础上分四组即(6.67kPa组、13.33kPa组、20.00kPa组、26.66kPa组)在恢复常压10min后再分别增压到6.67kPa、13.33kPa、20.00kPa、26.66kPa保持10min后取标本,恢复常压10min后再重复一次。对侧无灌注肾脏亦作穿刺,作为对照组标本。1.2双氧铀块染法前固定:2%戊二醛PBS固定液固定2h,4℃。漂洗:PBS缓冲液洗涤2次,每次10min,4℃。后固定:1%锇酸PBS固定液固定2h,4℃。漂洗:PBS缓冲液洗涤2次,每次10min,4℃。脱水:30%~50%~70%乙醇逐级脱水每次10min。(70%乙醇含3%醋酸双氧铀)4℃块染。80%~95%~100%~100%乙醇逐级脱水,每次10min。置换:环氧丙烷,二次,每次10min。浸透:环氧树脂618包埋液与环氧丙烷1∶12h。环氧树脂618包埋液与环氧丙烷2∶1过夜。纯环氧树脂618包埋液浸透,37℃,6h。包埋:60℃烘箱内48h。切片:LKBV型超薄切片机切片。染色:枸橼酸铅电子染色。观察:PHILIP(荷兰菲利浦公司)CM-120透射电镜观察肾小球、肾小囊、近曲肾小管及肾间质的改变。2结果2.1肾盂内基础压实验猪肾盂内基础压0.8~1.1kPa,平均(0.95±0.15)kPa,与人类肾盂内压0.98kPa相近。2.2肾组织病理学观察肾盂内灌流压为6.67kPa时,第一个10min,肾小球毛细血管上皮细胞(足细胞)足突排列整齐,足突间连接紧密,肾小囊基底膜连续性完好,近曲肾小管腔面微绒毛排列规则。20min、30min,在电镜下观察超微结构变化不大。肾盂内灌流压为13.33kPa时,第一个10min,肾小球足细胞足突排列整齐,连接紧密,肾小囊基底膜完好,近曲肾小管细胞腔面微绒毛排列规则(图1)。20min时,肾小球、肾小囊结构无变化,但可见部分肾小管上皮细胞内空泡形成,微绒毛排列杂乱、稀疏,部分微绒毛脱落(图2)。30min时,肾小球、肾小囊无变化,肾小管上皮细胞内空泡形成明显,有大片微绒毛脱落,偶见细胞溶解(图3)。肾盂内灌流压为20.00kPa时,第一个10min,肾小球、肾小囊结构无变化,近曲肾小管细胞亦变化不大。20min时,肾小球、肾小囊结构变化不明显,肾小管上皮细胞内空泡大量形成,微绒毛脱落,细胞内吞噬溶酶体增多,可见部分细胞的细胞膜、核膜及细胞器膜性结构破裂(图4)。30min时,肾小球、肾小囊管腔饱满,足突间的间隙变宽,肾间质组织肿胀,肾小管上皮细胞腔面微绒毛大片团状脱落,可见部分细胞溶解(图5)。肾盂内灌流压为26.66kPa时,第一个10min,足细胞足突排列尚整齐,肾小囊基底膜连续,但可观察到肾小管上皮细胞内空泡形成,微绒毛排列杂乱,部分微绒毛脱落,细胞内吞噬溶酶体增多(图6)。20min,可见部分肾小球、肾小囊饱满,多处肾小管微绒毛脱落,胞质内线粒体、溶酶体扩张,部分细胞分解、破裂,肾间质有水肿(图7)。30min,可见足突肿胀,足突间的间隙变宽,肾间质肿胀明显,有巨噬细胞侵润,肾小管上皮细胞团状脱落,部分细胞溶解坏死(图8,9)。3肾单位损害的发生此实验研究是吴荣佩动物研究的延续和发展,2006年,吴荣佩等在健康猪肾做了单纯性肾盂内高压灌注对肾单位影响的实验研究,分别在6.67、13.33、20.00、26.66、33.33、40.00kPa各级压力下灌流10min,实验中输尿管肾盂是在封闭状态恒压下肾盂内压等于灌流压,在每个压力状态下于肾上极、肾凸缘、肾下极各穿刺获取肾实质组织,在透视电镜下观察肾小球、肾小囊及近曲肾小管的形态变化,得出了肾盂内压不超过26.66kPa,可避免对肾单位造成结构破坏的结论。而在临床实践中我们发现接受灌流操作的患者肾脏可能已有肾积水等病变,且在操作中一度致肾内压升高的时间可大大超过10min,即使灌注压力不超过26.66kPa,也可能造成肾单位损伤,因此我们设计了此实验研究。实验研究发现肾盂内灌注压在6.67kPa时,在不同的时间累积里,肾小球、肾小囊、近曲肾小管及肾间质的改变不明显。肾盂内灌注压在13.33~26.66kPa时,在不同的时间累积里,肾小球、肾小囊的改变不明显;但近曲肾小管及肾间质的损伤改变明显,近曲肾小管上皮细胞微绒毛脱落、细胞膜及细胞器破裂等,肾间质肿胀、炎性细胞侵润等变化,并随时间积累而加剧。实验中我们发现肾单位中各组织的损害除压力大小时间外(压力与时间有关外),还与各组织在压力传递的梯级和本身对压力的耐受有关。肾盂和集合管是压力传递的第一梯级,由于本身有舒张性,所以各种压力对它影响不大;肾小球、肾小囊是压力传递的最末梯级,除非是极高压(26.66kPa以上)很难对它产生影响;远曲肾小管、近曲肾小管是压力传递的中间梯级,近曲小管由于上皮细胞存在微绒毛结构最易受损。近曲肾小管能重吸收肾小囊滤液中几乎全部葡萄糖、氨基酸和蛋白质,以及65%的Na、85%的水和50%的尿素等;近曲小管上皮细胞还向管腔分泌H+、氨、肌酐和马尿酸,转运排出血液中酚红和青霉素等药物;因此,近曲小管的损害可严重影响肾的正常排泄功能。我们还发现,随着时间的推移,各压力下,肾间质的变化明显;而在临床上也发现有些病患反复做多次输尿管镜碎石失败开放手术中发现肾纤维化的表现。是否与肾间质变化有关,需做远期变化的动物实验。自从用输尿管镜开展输尿管检查治疗及经皮肾盂检查治疗以来,为输尿管结石和肾结石开创了崭新的途径,为广大病患带来了福音;在操作中,为了保持视野清晰,我们常用灌注泵(压力0~53.33kPa)进行灌流,一般在流出道通畅的情况下,肾盂输尿管都保持低压状态,但在碎石或血块堵塞流出道时可致肾盂内压增高,达13.33kPa以上,有的甚至超过26.66kPa,对肾单位造成损害;这