代谢组学的研究与应用

代谢组学的研究与应用

随着人类科学研究项目的实施，阐明、序列遗传因素和蛋白质遗传因素在人类生命周期研究中发挥着重要作用。与此同时，代谢遗传因素（mei综合征）出现并迅速发展，它们与基础研究、序列研究和蛋白质研究一起组成了“系统生物学”。基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学等各种“组学”在生命科学领域中发挥了重要的作用,它们分别从调控生命过程的不同层面进行研究,使人们能够从分子水平研究生命现象,探讨生命的本质,逐步系统地认识生命发展的规律。这些“组学”手段加上生物信息学,成为系统生物学的重要组成部分。代谢组学的出现和发展是必要的,同时也是必须的。对于基因组学和蛋白质组学在生命科学研究中的缺点和不足,代谢组学正好可以进行弥补。代谢组学研究的是生命个体对外源性物质(药物或毒物)的刺激、环境变化或遗传修饰所做出的所有代谢应答,并且检测这种应答的全貌及其动态变化。代谢组学方法为生命科学的发展提供了有力的现代化实验技术手段,同时也为新药临床前安全性评价与实践提供了新的技术支持与保障。1代谢组学的界定及其应用代谢组学metabonomics最初是由英国帝国理工大学JeremyNicholson教授提出的,他认为代谢组学是将人体作为一个完整的系统,机体的生理病理过程作为一个动态的系统来研究,并且将代谢组学定义为生物体对病理生理或基因修饰等刺激产生的代谢物质动态应答的定量测定。2000年,德国马普所的Fiehn等提出了metabolomics的概念,但是与Nicholson提出的metabonomics不同,他是将代谢组学定位为一个静态的过程,也可以称为“代谢物组学”,即对限定条件下的特定生物样品中所有代谢产物的定性定量分析。同时Fiehn还将代谢组学按照研究目的的不同分为4类:代谢物靶标分析,代谢轮廓(谱)分析,代谢组学,代谢指纹分析。现在代谢组学在国内外的研究都在迅速地发展,科学家们对代谢组学这一概念也进行了完善,作出了科学的定义:metabonomics/metabolomics是对一个生物系统的细胞在给定时间和条件下所有小分子代谢物质的定性定量分析,从而定量描述生物内源性代谢物质的整体及其对内因和外因变化应答规律的科学。与基因组学、转录组学、蛋白质组学相同,代谢组学的主要研究思想是“全局观点”。与传统的代谢研究相比,代谢组学融合了物理学、生物学及分析化学等多学科知识,利用现代化的先进的仪器联用分析技术对机体在特定的条件下整个代谢产物谱的变化进行检测,并通过特殊的多元统计分析方法研究整体的生物学功能状况。由于代谢组学的研究对象是人体或动物体的所有代谢产物,而这些代谢产物的产生都是由机体的内源性物质发生反应生成的,因此,代谢产物的变化也就揭示了内源性物质或是基因水平的变化,这使研究对象从微观的基因变为宏观的代谢物,宏观代谢表型的研究使得科学研究的对象范围缩小而且更加直观,易于理解,这点也是代谢组学研究的优势之一。代谢组学的优势主要包括:对机体损伤小,所得到的信息量大,相对于基因组学和蛋白质组学检测更加容易。由于代谢组学发展的时间较短,并且由于代谢组学的分析对象是无偏向性的样品中所有的小分子物质,因此对分析手段的要求比较高,在数据处理和模式识别上也不成熟,存在一些不足之处。同时生物体代谢物组变化快,稳定性较难控制,当机体的生理和药理效应超敏时,受试物即使没有相关毒性,也可能引起明显的代谢变化,导致假阳性结果。代谢组学应用领域大致可以分为以下7个方面:(1)植物功能基因组研究,主要以拟南芥为研究模型,也包括一些转基因作物的研究;(2)疾病诊断,根据代谢物特征图谱诊断肿瘤、糖尿病等疾病;(3)制药业即新药临床前安全性评价,主要通过高通量比对预测药物的毒性和有效性,通过全面分析来发现新的生物指示剂;(4)微生物领域;(5)毒理学研究,包括利用代谢组学平台研究环境毒理及药物毒理;(6)食品及营养学,即研究食品中进入体内的营养成分及其与体内代谢物的相互作用;(7)在中药现代化及其机理上的研究。2生物代谢的特征代谢组学的研究过程一般包括代谢组数据的采集、数据预处理、多变量数据分析、标记物识别和途径分析等步骤。首先,采集生物样品(如尿液、血液、组织、细胞和培养液等),对其进行生物反应灭活、预处理。再运用先进的分析手段如核磁共振、质谱或色谱等检测样品中所有代谢物的种类、含量、状态,从而得到原始的大量的反映生物样品信息的实验数据,而后使用多变量数据分析方法对获得的多维复杂数据进行降维和信息挖掘,从这些复杂大量的信息中筛选出最主要的最能反映代谢物变化的主要成分,再通过模式识别将其与标准的代谢物谱进行比对,或是根据代谢物谱在时程上的变化来寻找生物标记物,研究相关代谢物变化涉及的代谢途径和变化规律,以阐述生物体对相应刺激的响应机制。同时由于不同分析手段各有其特点,在不同应用领域使用的分析方法也是有所不同的。2.1nmr检测灵敏度和高效性核磁共振(nuclearmagneticresonance,NMR)是有机结构测定的四大谱学之一,作为一种分析物质的手段,由于其可深入物质内部而不破坏样品,并具有迅速、准确、分辨率高等优点而得以迅速发展和广泛应用。在代谢组学发展的早期,NMR技术被广泛应用在毒性代谢组学的研究中。NMR的优势在于能够对样品实现无创性、无偏向的检测,具有良好的客观性和重现性,样品不需要烦琐处理,具有较高的通量和较低的单位样品检测成本。此外,1H-NMR对含氢化合物均有响应,能完成样品中大多数化合物的检测,满足代谢组学中的对尽可能多的化合物进行检测的目标。NMR虽然可对复杂样品如尿液、血液等进行非破坏性分析,与质谱法相比,它的缺点是检测灵敏度相对较低(采用现有成熟的超低温探头技术,其检测灵敏度在纳克级水平)、动态范围有限,很难同时测定生物体系中共存的浓度相差较大的代谢产物;同时,购置仪器所需的投资也较大。为了改进NMR检测灵敏度较低的缺点,可采用高分辨核磁共振技术或使用多维核磁共振技术和液相色谱-核磁共振联用(LC-NMR)。魔角旋转(magicanglespinning,MAS)核磁共振技术是20世纪90年代初发展起来的一种新型的核磁共振技术,在代谢组学的研究中,魔角旋转核磁共振波谱技术已被成功地应用到研究生物组织上,因为生物组织在核磁共振实验中会由于磁化率不均匀、分子运动受限等因素而引起谱线增宽。这些因素利用固体核磁共振中的MAS方法可以消除。例如大鼠肝脏、哺乳动物肾脏以及大鼠睾丸组织等。2.2gc-ms和ms的联用技术在代谢组学的研究中,气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术在植物代谢组学、诊断代谢组学、药物毒理等领域有广泛的应用。有研究表明,采用GC-MS来检测大鼠尿样中内源性的代谢产物可以检测出49种,并且有26种代谢产物的检测可以达到定量标准。GC-MS在植物代谢组学的研究中最为广泛。它的优势在于能够提供较高的分辨率和检测灵敏度,并且有可供参考、比较的标准谱图库,可以方便地得到待分析代谢组分的定性结果。局限性表现在GC只能对其中的挥发性组分实现直接分析,从而得不到体系中难挥发的大多数代谢组分的信息。如陆益红等利用GC-MS技术探讨自发性高血压大鼠(SHR)和正常大鼠(WKY)血浆代谢组差异,确证高血压模型,在此基础上探讨人参总皂苷对SHR血压及代谢组的影响,应用GC-MS测定内源性代谢物,用主成分分析(PCA)和偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)鉴别两组动物的代谢谱及引起高血压的生物标记物。GC-MS联用技术在代谢组学的其他方面的应用也很广泛,如王晓艳等对冷应激及其药物干预的代谢组学进行研究。采用衍生化GC-MS的方法分析尿液中内源性小分子代谢物,结合主成分分析、最小二乘法等模式识别方法计算峰响应信号,冷应激前后正常大鼠尿液内源性代谢物在主成分分析图上产生显著分离,人参皂苷组则冷应激前后几乎无分离。从代谢物的角度证实冷应激对动物机体的影响、机体的自我恢复以及人参皂苷的抗应激作用。2.3采用lc-ms方法进行代谢组学代谢组学研究所用到的三大分析技术中,液相色谱-质谱(LC-MS)联用技术可以说是最晚在代谢组学领域得到开发与利用的,由于LC-MS联用技术本身的强大优势,及其与NMR技术和GC-MS联用技术的互补性,虽然起步较晚,但它的发展速度及应用频率正在大大提高中。LC-MS和GC-MS联用技术都可以同时检测出数百种化合物,包括糖类、有机酸、氨基酸、脂肪酸和大量植物的次级代谢产物。但是GC-MS技术需要先对样品进行衍生化预处理,这一步骤耗时而且容易引起样品的变化。而LC-MS技术不受此限制,其与NMR相比又具有经济实用的优点,适用于那些热不稳定、不易挥发、不易衍生化和相对分子质量较大的物质。在代谢组学的研究中,LC-MS已经广泛应用在疾病诊断[15,16,17,18,19,20,21]、毒理学分析、中药机理方面研究、植物代谢组学、物种差异的研究以及微生物代谢物研究等方面。其中,寻找与疾病相关的生物标记物是近年来代谢组学研究中的热门领域,它主要是通过对待测样品与对照样品的LC-MS分析,从得到的色谱图和质谱图中提取数据,再应用一系列的数据处理手段,如峰检测、峰对齐、滤噪等等,将从LC-MS分析中得到的大量的复杂数据简单化,这种被简化后的数据所呈现出的谱图很容易就能观察到样品之间的差异。而为了能够更加清晰地识别这种差异,通常采用化学计量学的方法,应用特殊的统计学软件,对大批量的数据进行聚类分析,在应用LC-MS进行代谢组学的研究中通常使用的是主成分分析法PCA和偏最小二乘法PLS。这样经过软件的数据分类与特殊离群点的寻找等过程,就可以轻松地发现造成不同样品组差异聚类的原因。根据MS的信息及与NMR技术的联用就能够确认这些生物标记物的化学结构。在代谢组学中寻找与疾病、毒性相关的生物标记物对临床应用具有重要意义,比如支持疾病的临床诊断和预后评估,建立毒性评价系统等等。在代谢组学的研究中,采用LC-MS分析手段与NMR、GC-MS技术有其相同之处,也有其特殊的地方。它的分析对象主要是尿样、血浆和血清。针对不同的样品,处理方法也是不同的。尿样一般都是经过12000～16000r·min-1的高速离心,将尿液中的微粒去除,吸取上清液稀释,过0.22μm的滤膜后即可进样分析。由于尿样中含有一定量的高分子物质,因此尿样一定要离心、过滤后才能进样,同时稀释样品可以起到降低复杂基质对分析结果的影响。同时有文献表明,在对尿样进行稀释时所使用的溶剂对LC-MS得到的结果也存在一定的影响。在该文献中采用3种不同的方式处理尿样,分别为不稀释尿样、用水稀释尿样及用甲醇稀释尿样,最后通过比较图谱发现使用水对样品进行稀释后使信号降低,检测出的色谱峰减少,而用甲醇稀释重复性好,因此用甲醇处理更适合对某类性质相似的物质代谢组学的分析,而不进行稀释处理样品可能适用于全面广泛的代谢组学研究。虽然不进行样品稀释得到的结果较好,但是并不能忽视高分子如蛋白质、某些盐类对LC-MS的影响,可能会造成保留时间的迁移,而采用超高效液相色谱(UPLC)法可以降低基质效应,保留时间迁移减小。在尿样的处理中还可以应用固相萃取(SPE)技术和亲和色谱的方法对样品中某些特殊性质的成分进行提取,如采用苯基硼酸亲和凝胶色谱法提取尿样中的核苷。采用SPE方法对人的尿液和猫的尿液进行萃取,具有快速、简便的特点。针对血浆及血清样品的处理,一般是将血液放入加入抗凝剂或是不加入抗凝剂的试管中,通过低速离心(3000～4000r·min-1)后,得到血浆或是血清样品,需要注意的是血清样品一般要在室温下放置1～2h后再离心。最后加入有机溶剂甲醇或乙腈沉淀蛋白,低温高速离心后吸取上清液进样分析。生物样品的储存条件对代谢组学分析存在一定的影响,生物样品在LC-MS自动进样器中的稳定性为4℃存在20h,在-20℃条件下可以稳定存在1个月,同时样品经过9次冻融循环后就可造成样品发生小部分变性。在采用LC-MS方法对样品进行分析处理及采集数据时,流动相的组成、梯度洗脱程序、运行时间、每一针之间的污染等问题都可能对代谢组学数据处理造成影响。关于流动相的组成一般采用的乙腈-水的体系,在其中添加一定比例的缓冲盐有利于改善峰形,可以加入甲酸/甲酸铵或是醋酸/醋酸铵,甲酸铵主要在质谱方面应用广泛,而采用醋酸铵可以提高结果的重现性。调节pH可以改善色谱峰的脱尾现象。除流动相的组成外,由于代谢组学要求分析的是“全体”代谢产物,因此一般会采用梯度洗脱程序,通过对一步梯度、曲线梯度、线性梯度的考察,发现一步梯度得到的色谱峰分离度较好,数量多;线性梯度在3种方式中得到的色谱峰数是最少的,而曲线梯度得到的图谱保留时间有一定的迁移。梯度洗脱程序的运行时间也对结果有影响,在阳离子检测模式下,随着运行时间的延长,检测到的色谱峰变多,峰变窄,但是日间变异率也增大;流速低得到的日间变异率也低。这说明延长运行时间可以优化分离度,增加灵敏度;降低流速可以得到更多的可重复的特征峰。由于代谢组学分析样品的数量较大,因此为防止在自动进样时样品之间的交叉污染,要在进样之间进行洗针,一般就是采用所用的流动相进行洗针从而防止样品间污染。在代谢组学中一般色谱柱的型号是内径3mm或4.6mm,粒径从3μm到5μm,长度从50mm到250mm,色谱柱的选择是根据分析样品性质的不同而确定的。在样品处理及数据采集后是对大批量的数据进行统计学分析,现在常用的是主成分分析PCA和偏最小二乘-显著性分析(PLS-DA)联合法。通过主成分分析得分图可以用来说明数据群的分类聚集情况,载荷图可以用来寻找在数据群分类时起到主要作用的化合物,再通过LC-MS方法对载荷点所对应的保留时间和质荷比进行结构解析,最终得到生物标记物的化学结构。一般采用的软件包括:①theShimadzuClass-VPversion6.10software,此软件用来将数据变化为CSV格式,然后峰经过一系列的对齐,归一化后进行主成分分析;②SIMCA-P(Version10.0.2;Umetrics,Sweden),此软件可进行PCA和PLS-DA分析;③MicromassMarkerLynxApplication,version4.0(Waters,Milford,MA,USA),此软件可以进行峰检测和峰对齐。2.3.1uplc-tof-ms的联用方法超高效液相色谱(ultraperformanceliquidchromatography,UPLC)是指一种采用小颗粒填料色谱柱(粒径小于2μm)和超高压系统(压力大于105kPa)的新型液相色谱技术,能显著改善色谱峰的分离度和检测灵敏度,同时大大缩短分析周期。因此特别适用于微量复杂混合物的分离和高通量研究。UPLC与MS、MSn等设备的联用技术发展很快,现已成功应用于农药残留物检测、水质和环境监测、化妆品质量控制、药物及制剂的分析检测和质量控制、中药复杂组分分析及代谢组学等领域。UPLC是具有超高分离度、超高速度、超高灵敏度的HPLC。实验表明,与传统的HPLC相比,UPLC的速度、灵敏度及分离度分别是HPLC的9倍、3倍及1.7倍。超高效液相色谱飞行时间质谱(ultraperformanceliquidchromatography-timeofflightmassspectrum,UPLC-TOF/MS)联用技术是近年发展起来的一种对分析复杂样品很有效的方法。在分析尿样时由于其中数以千计的代谢产物大部分为结构完全未知的化合物。对于它们的鉴定,最好是采用柱后收集的方法得到一定量的纯品,然后通过NMR、红外光谱(IR)、紫外光谱(UV)、MS等多种方法的协作来确定其结构,UPLC-TOF/MS的分离分析平台可以提供有关化合物的保留时间、精确质量、MS/MS数据以及单波长(254nm)紫外吸收情况,经过这些有用数据信息的合理分析与整理,可以得到化合物的分子式及相对分子质量,再通过数据库检索可得到相应的结构。在代谢组学中,UPLC与TOF-MS的联用技术被应用到了多个领域中,包括疾病诊断、毒性研究等等,其中UPLC-TOF/MS在对中药作用机理的研究中有广泛的应用,同时还能够对中药的药效进行评价。LC与MS联用时流速的设定要考虑到分析时间、质谱系统的耐受性等因素,因此采用较低的流速可以不经分流直接导入MS系统进行检测。同时由于UPLC对复杂样品的分离能力强,而良好的分离可以降低MS检测时的离子抑制效应。UPLC固定相的种类对分析样品的能力也有一定的影响,由于C18柱对脂溶性的物质的保留相对较强,对样品的分析效率较低,因此采用C8和苯基柱分离效率要好,同时由于C8柱比苯基柱的选择范围要广,因此C8柱最适合分析代谢组学中的血浆样品。在分析尿样等复杂生物样品时,一般要采用梯度洗脱程序可以得到良好的分离结果。近年来有实验表明,柱温箱的温度提高或梯度洗脱程序升高也可以明显改善分离效果,对峰形也有改善。这种高温超高效液相色谱(HT-UPLC)由于提高了柱温使流动相等溶剂更易挥发,在MS检测时可以得到更多的离子,分离效果也被大大提高。2.3.2在热价组成结构上的应用亲水作用色谱(hydrophilicinteractionchromatography,HILIC)又称为“反相反相色谱”或“含水正相色谱”,HILIC的洗脱是以化合物亲水性增加的次序排列。在HILIC中,流动相中的有机组分是弱洗脱剂,水相是强洗脱剂。如此性质不仅使之具有与反相色谱互补的选择性,而且其流动相可以具有更高的挥发度,增加了LC-MS分析灵敏度,降低了分离的操作压力。由于代谢产物经常比母体化合物极性更强,浓度更低,这使得利用反相LC-MS保留、分离与检测这类物质非常困难。不同于反相色谱选择性的HILIC色谱柱对极性代谢产物的保留能力更强,使得代谢产物较疏水性更强、浓度更高的母体药物在色谱上有更长的保留时间,因而最大程度地摆脱了在色谱图前端发生的质谱离子抑制现象的影响。在代谢组学的应用中,HILIC正好与反相HPLC(reversedphase-HPLC,RP-HPLC)和UPLC相互补充。HILIC可以明显改善极性物质及离子性质化合物的保留时间,增加MS的电离效率,流动相的黏度较低导致分离速度比反相LC(RPLC)要快。由于大鼠尿样中的内源性代谢产物有一些是极性较大的物质,而这些物质在普通的RP-HPLC色谱柱上保留很弱或是没有保留,因此亲水作用色谱柱对RP-HPLC在极性物质的保留上有互补作用。采用ZIC-HILICcolumn(3.5μm,2.1mm×100mm)对大鼠尿液进行分析,发现在C18柱上保留差的物质保留行为良好,同时出峰时间向后迁移,使色谱峰不再积压在一起,使用HILIC柱的出峰顺序与使用普通的C18柱的出峰顺序是相反的,并且对中等极性的物质改变不大,对脂溶性物质不保留。由于HILIC和RP-HPLC分析对象的范围是不同的,因此采用HILIC与RP-HPLC联用技术对大鼠的尿液进行特征图谱分析,可以将尿液中全部极性范围内的物质进行详细的分离分析,同时也扩大了代谢组学寻找与疾病、毒理、药理相关的生物标记物的范围。对于“组学”要求的无目标性分析,这种HILIC和RPLC的联用技术正好可以扩大检测化合物的数量。RPLC的分离主要是对非水性物质的选择性,要在RPLC上分析极性物质往往要用大比例的水作为流动相或是在流动相中添加一定量的离子对试剂,这种方法会造成很多问题,如加大水相的比例可能会