第三章 基因工程工具酶

第三章基因工程工具酶Instrumental

enzyme

of

gene

engineering应用于基因工程的各种酶的总称，包括核酸序列分析、标记探针、载体构建、目的基因选取、重组的、DNA制备等程序中所需要的酶类。主要是限制性核酸内切酶和DNA连接酶，末端转移酶、单链核酸酶和反转录酶。所以把这些酶称为“基因工程工具酶”。工具酶是对野生菌株（或真核生物如酵母）进行改造、优化、而产生的生物工程产品。核酸内切酶核酸外切酶DNA聚合酶RNA聚合酶DNA连接酶甲基化酶核苷酸激酶核苷酸转移酶磷酸酶3.1

限制性核酸内切酶5’5’GC

AA

TGCTTAGCC

ATCGTTACGAATCGG

TA核酸外切酶核酸内切酶核酸外切酶5’5’GCAAGCT

TTAGCC

ATCGTT

CGA

AATCGGTA限制性核酸内切酶

能在特异位点（酶切位点）上催化双链DNA分子的断裂,产生相应的限制性DNA片段。切割不同来源的DNA分子将产生特征性限制性酶切图谱，具有重大应用价值（“分子手术刀”）。AGCTAGCTAGCTAGCTAGCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAluⅠ（+）（-）电泳Phageλ感染E.coli

k

（k）

E

.coli

B

(E

.coli

B

限制

λ（k）)

不感染

②

仍有少量λ(K)可在

E.coli

B中生存，是因

E.coliB对λ(K)DNA进行了修饰。E.coli

B修饰λ(k)*感染E.coli(B)-

λ细菌如何对λ噬菌体进行限制和修饰

?

3.1.1

细菌的限制-修饰系统

①

50年代后Luria和Human(1952)

Bertani和Weigle(1953)发现细菌的“限制”现象：•细菌的限制—修饰系统①

1962年W.Arber(瑞士)发现，寄主对噬菌体的修饰是在Phageλ的DNA上。②

1965年，Arber发现修饰与λ的降解有关，提出：细胞中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，即细胞中有限制—修饰系统(R-M

Restriction-modification

system)。R-M系统是细菌安内御外的积极措施。

限制—修饰的酶学假说

酶切位点

不被修饰

酶切位点

被修饰Methylation

限制性核酸内切酶

(B)

(B)

噬菌体DNA

被切割

基因组DNA

不被切割

识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链

主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵1968年，Meselson

和Yuan从大肠杆菌K和B中发现了I型限制性核酸内切酶1970年，Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离纯化了第一个II型限制性核酸内切酶Hind

II，使得DNA分子的体外精确切割成为可能。1978年，W.Arber、H.O.Smith(美)，Nathans(美)因发现限制性内切酶及对其功能研究的突出贡献获得诺贝尔奖金。截止到目前为止，已经分离出400余种II类酶，搞清识别位点的有300种，商品化的约有100种，而实验室常用的有20种。

3.1.2

限制性核酸内切酶的分类4.

切割位点5.

特异性切割6.

基因克隆中I型1.

限制修饰活性

单一多功能的酶2.

内切酶的蛋白

3种不同亚基

质结构限制辅助因子

ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸距特异性位点1000bp不是无用II型单一成分Mg2+是非常有用III型限制酶和修饰酶分开

双功能酶2种亚基ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸特异性位点及其附近

特异性位点3‘端

24-26bp处是有用

3.1.3

II型限制性核酸内切酶的特点1、识别位点的特异性:

每种酶都有其特定的DNA识别位点，通常是由4～8个核苷酸组成的特定序列（靶序列）例如：

HindⅡ

MboⅠ5’

-

GTPyPuAC

–

3’5’

-

GATC

–

3’2、识别序列的对称性:

靶序列通常具有双重旋转

对称的结构，即双链的核苷酸顺序呈回文结构。3、切割位点的规范性:

双链DNA被酶切后，分布在两条链上的切割位点旋转对称（可形成粘性末端或平末端的DNA分子）。4、识别序列中的碱基被甲基化修饰后会影响部分酶的切割作用效果。3.1.4

限制性内切酶的切割方式限制性核酸内切酶－“分子手术刀”“切哪里”?磷酸二酯键怎样切？•

基因的剪刀——限制性内切酶（简称限制酶）

例：大肠杆菌(E.coli)的一种限制酶能

识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。

限制酶限制酶

几种II型限制性核酸内切酶的酶切位点Pst

IProvindencia

stuartii

164CTGCAG

GACGTCHaemophilus

influenzae

Rd•

什么叫黏性末端？被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。

3’黏性末端；5’

黏性末端5’3’练一练5、原核6、核苷酸7、磷酸二酯键8、黏性末端9、平末端3.1.5

限制性核酸内切酶的命名-1973

Smith和Nathams1、寄主菌属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个斜体

字母的略语表示酶来源的菌种名称，如大肠杆菌Escherichia

coli

表示为Eco

,

流感嗜血菌Haemophilus

influenzae

表

示为Hin；2、用1个正体字母表示菌株的类型，比如EcoR、Hind，若酶存在于质粒上，则需大写字母表示非染色体遗传因子；3、该菌株（种）中发现的不同的酶按照顺序以罗马字母编号I,II,

III等。

3.1.6

同裂酶和同尾酶

同裂酶（isoschizomer）：是指来源不同的但却具有相同的识别序列，切割DNA后产生相同末端（或不同末端）的一组限制酶。Kpn

IAsp

7185’……GGTAC

C……3’5’……GGTAC

C……3’Xma

ISma

I同序同切5’……

C

CCGGG

……3’

同序异切

5’……

CCC

GGG

……3’

同尾酶（isocaudamer）：是指来源不同、识别序列也不同但切割后产生相同的黏性末端一类限制酶。

经同尾酶消化的DNA末端连接示意图

BamH

I5’

XXXXGGATCCXXXXXX

3’3’

XXXXCCTAGGXXXXXX

5’5’

XXXXGGATCCXXXXXX

3’3’

XXXXCCTAGGXXXXXX

5’

Bgl

II5’

XXXXAGATCTXXXXXX

3’3’

XXXXTCTAGAXXXXXX

5’5’

XXXXAGATCTXXXXXX

3’3’

XXXXTCTAGAXXXXXX

5’5’

XXXXAGATCCXXXXXX

3’3’

XXXXTCTAGGXXXXXX

5’BamH

I

5’

XXXXAGATCCXXXXXX

3’

Bgl

II

3’

XXXXTCTAGGXXXXXX

5’3.1.7

限制性内切酶识别序列出现的几率及酶切片段的估算

II型限制性核酸内切酶的切割位点是：A

识别序列内

B识别序列1000bp以外C识别位点下游24－26bp处DDNA分子任一位点

重组DNA技术中常用的工具酶下列那项不是：限制性核酸内切酶B.DNA连接酶C.DNA聚合酶I

D.RNA聚合酶关于基因工程的叙述，下列哪项是错误的?A.基因工程也称基因克隆

B.只有质粒DNA可作为载体

C.重组体DNA转化或转染宿主细胞

D.需获得目的基因有关噬菌体的叙述哪项不符合?A.感染大肠杆菌时仅把DNA注入大肠杆菌内

B.只有裂解一种生活方式

C.溶源和裂解两种生活方式可以相互转变

D.噬菌体是由外壳蛋白和DNA组装而成某一重组DNA的载体部分有两个BamHI酶切位点。用BamHI酶切后凝胶电泳上出现四条长度不同的带子，其长度总和与已知数据吻合，该重组分子插入片段上的BamHI酶切位点共有A.4个 B.3个 C.1个 D.2个下列五个DNA片段中含有回文结构的是A.GAAACTGCTTTGAC B.GAAACTGGAAACTGC.GAAACTGGTCAAAG D.GAAACTGCAGTTTC限制性核酸内切酶是由细菌产生的，其生理意义是A修复自身的遗传缺陷 B促进自身的基因重组C强化自身的核酸代谢 D提高自身的防御能力

3.1.8

影响限制性内切酶活性的因素

DNA纯度DNA的甲基化程度DNA的分子结构限制性核酸内切酶的缓冲液酶切消化反应的时间和温度反应体积和甘油浓度

酶单位的定义和影响酶活性的因素

一个酶单位（U）指：在理想的反应条件（适宜的缓冲液和反应温度，通常为37℃）下，1min内引起1μmol底物发生反应的酶量。Buffer

(10X)WaterDNAEnzymeVolume

2.0

L16.5

L

1.0

L

0.5

L

20.0

L电泳紫外分析37℃

1h加反应液M1.0kb1.0kb0.6kb0.5kb0.4kbMCK

TCK

T_＋

酶切反应的基本步骤

酶量的确定：2-3

倍才能保证完全消化；DNA识别位点的密度有关酶切操作注意事项

选择正确的酶DNA的纯度和浓度反应体系甘油的量<5%（酶保存在50％甘油中，故所加酶液体积最多为酶切反应总体积的1/10）。酶保存在-200C；使用时在冰浴上操作。反应体系各成分都加完后，最后加酶。每次取酶液用新的枪头，防止交叉污染。防止任何可能引起酶蛋白变性的因素，如：气泡、去污剂星活性（star

activity）

指限制性内切酶在非标准条件下，对与识别序列相似的其它序列也进行切割反应，导致出现非特异性的DNA片段的现象。易产生星活性的内切酶用*标记。如：EcoR

I*NEB已证实下列酶存在星号活性：ApoI、AseI、BamHI、BssHII、EcoRI、EcoRV、HindIII、HinfI、PstI、PvuII、SalI、ScaI、TaqI、XmnI。

导致星号活性的因素：

1.

较高的甘油浓度（>5%v/v）；

2.

酶与底物DNA比例过高（不同的酶情况不同，通常为>100U/µg）；

3.

低盐浓度（<25mM）

4.

高pH值（>pH8.0）

5.

存在有机溶剂（如二甲基亚砜(DMSO)、乙醇、乙烯乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺等）

6.

用其他二价离子替代镁离子（如Mn++，Cu++，Co++，Zn++等）

以上因素的影响程度因酶的不同而有所不同。例如EcoRI比PstI对甘油浓度更敏感，而后者则对高pH值更敏感一些。

抑制星号活性的方法：

1.

尽量用较少的酶进行完全消化反应。这样可以避免过度消化以及过高的甘油浓度。

2.

尽量避免有机溶剂（如制备DNA时引入的乙醇）的污染。

3.

将离子浓度提高到100-150mM（若酶活性不受离子强度影响）。

1、重组DNA前的切割2、构建新质粒3、构建物理图谱4、DNA分子杂交5、制备DNA探针6、亚克隆以用作序列分析7、基因定位，DNA同源性研究。

4363pBR322物理图谱探针：在分子杂交中用来检测互补序列的带有标记的单链DNA或RNA片段。亚克隆:

用限制性酶切或PCR等手段从已经克隆的DNA中获得该克隆DNA的部分序列或改造过的序列，再克隆到另外的新载体中的技术。作业1：限制性内切酶的应用作业2

为了绘制长为3.0kb

BamH

Ⅰ限制性片段的限制性图谱，分别用EcoRⅠ、Hpa

Ⅱ、

EcoR

Ⅰ+Hpa

Ⅱ消化这一片段的三个样品，然后通过凝胶电泳分离DNA片段，溴化乙锭染色后观察DNA带型。请根据这些结果绘制一个限制性图谱，要标明EcoR

Ⅰ和Hpa

Ⅱ识别位点间的相对位置，以及它们之间的距离（kb）。EcoR

Ⅰ+Hpa

ⅡEcoR

Ⅰ

1.7kb0.9kb0.4kbHpa

Ⅱ

1.6kb1.4kb1.2kb0.9kb0.5kb0.4kb3.2

DNA连接酶

Nick

Nick

环形DNA分子的发现使科学家相信一定有一种能

连接这种Nick的酶存在。1967年，世界上几个实验室几乎同时发现了一种能够催化在2条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶——DNA连接酶（ligase）。DNA连接酶

：由大肠杆菌基因组DNA编码，以NAD+作为能源辅助因子。只能连接粘性末端T4DNA连接酶：

由大肠杆菌T4噬菌体DNA编码，以ATP作为能源辅助因子。1970年：容易制备，而且可以连接平末端DNA分子及单链DNA(RNA)分子，所以在基因克隆中应用广泛。DNA连接酶作用的特点A.

连接的两条链必须分别具有

3′端自由羟基（-OH）和5

′端磷酸基团（-P），而且只有这两个基团彼此相邻时才能进行连接反应；B.

在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键是一种耗能过程，因此连接反应必须有能量分子的参与，通常有两种能量分子，即ATP和NAD+。

是两条链－因此不能将两条单链连接起来或使单链

环化起来。是相邻的－因此不能封闭gap，只能封闭nick。

gap

NickNONOOH

POKNODNA

连接酶连接的作用机制E－AMP

＋DNA＝DNA－AMP＋E⑴E(酶)＋ATP→E－AMP＋ppiE(酶)＋NAD→E－AMP＋NMN⑵⑶DNA上的3’－OH对被活化的磷原子进行亲核攻击，形成磷酸二酯键，同时释放出AMP。4℃

过夜加反应液

DNA连接反应的条件

连接反应最佳温度为37℃，但是此时黏性末端间氢键结合不够稳定，而且酶活性也会迅速降低。比如，EcoRI黏粘性末端连接部位只有4个碱基对，很容易断开。所以通常在4-16℃连接。影响连接效率的因素有：A.

温度（最主要的因素）B.

ATP的浓度(

10

M

-

1

M

)C.

连接酶浓度（平末端较黏性末端要求高）D.

反应时间（通常连接过夜）E.

插入片段和载体片段的摩尔比1.黏性末端DNA片段的连接NickNickDNA体外连接

2.平末端DNA片段的直接连接法

和末端加尾连接法3’3’5’5’3’3’5’5’末端核苷酸转移酶+dATP+dTTP3’3’5’5’3’5’5’AAAAA

3’TTTTDNA聚合酶和T4DNA连接酶DNA体外连接同聚物加尾法用5’

末端特异的核酸外切酶处理DNA片断在A和B分别中加入dATP和dTTP同聚物尾巴10~40个碱基常用的平末端DNA片段连接法衔接物(linker)

，是有人工化学合成的一段10-12个核苷酸的DNA双链，其中包含有1个或几个限制性酶切位点。使用时只须将衔接物和目的片段的5′端用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后用T4DNA连接酶进行连接，就可获得能产生黏性末端的DNA片段。CCGAATTCGGGGCTTAAGCC磷酸化CCGAATTCGGPOHOHGGCTTAAGCC

PPPOHOHT4连接酶

POHEcoR

I

OHCCGAATTCGGGGCTTAAGCCPAATTCGG

GCCCCGAATTCGGGGCTTAAGCC

CCG

GGCTTAA接头平末端DNA片段连接法衔接物连接法cDNA链的合成双衔接物连接法的基本程序通过DNA聚合酶合成第二链加入Sal

I衔接物S

I核酸酶作用后的末端单链突出序列，由Klenow补齐，加入第二衔接物Ecol

I平末端DNA片段连接法衔接物缺点

在用DNA衔接物连接法时，如果待克隆DNA的片断或基因内部，含有与所加衔接物相同的限制位点，在酶切消化衔接物产生粘性末端的同时，也会把克隆的基因切断。DNA接头（adapter）连接法：1978年，美国康奈尔大学生化分子生物学系的教授吴瑞博士发明的。它是一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片断。

黏性末端容易通过碱基配对形成如同衔接物一样的二聚体分子。对DNA接头分子末端，进行必要的修饰。移走粘性末端5’-P，暴露出5’-OH，不能产生稳定的二聚体分子。常用的平末端DNA片段连接法DNA接头DNA接头连接法1.

大肠杆菌DNA聚合酶I2.

Klenow片段3.

T4

DNA聚合酶4.

T7

DNA聚合酶5.

逆转录酶（反转录酶）6.

Taq

DNA聚合酶3.3

DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶I

（E.

Coli

DNA

pol

I）

Kornberg

1956年首先从大肠杆菌E.Coli

细胞中分离出来的。

它是一种多功能性的酶，包括3种不同的酶活力：A.

5′-

3′聚合酶活性

以双链DNA为模板，催化单核苷酸结合

到引物的3′末端，并不断延伸。B.

5′-

3′外切酶活性

将双链DNA中游离的5′末端逐个切去。C.

3′

-

5′外切酶活性

将游离的双链或单链DNA的3′端降解。

不过对于双链的降解可被5′-3′的多聚活性所抑制。大肠杆菌三种DNA聚合酶特性比较

大肠杆菌聚合酶Ⅰ的应用示例

缺口平移：双链DNA的单链缺口在DNA聚合酶Ⅰ的5’-3’外切作用下，从缺口的5’端逐步水解核苷酸时，酶的聚合活性则利用缺口的3’端游离羟基逐个加上相应的单核苷酸，使得缺口向下游移动。5’

5’

5’

3’

3’

3’

1.纯化的DNA片段2.DNaseI制造单链切口4.DNAPolI进行切口转移3.一种

-32P-dNTP和dNTPs

5’

5’

5’

5’

5’

3’

3’

3’

3’

3’

32P-dNTP32P-dNTP从头至尾都被标记大肠杆菌DNA聚合酶I

发挥作用的三个条件底物和激活剂带有3’-OH末端的引物DNA模板大肠杆菌DNA聚合酶I

的三种用途A.

制备DNA探针利用其3′--5′的外切酶活性及其聚合酶活性。B.

用于DNA连接后的大缺口填充利用5′--3′的聚合酶活性。C.

用于DNA的序列分析利用5′--3′的聚合酶活性。

Klenow片段Klenow片段大肠杆菌聚合酶I全酶经枯草杆菌蛋白酶处理后产生的大片段酶分子，它仍然有5′→3′的聚合酶活性和3′→

5

′的核酸外切酶活性，但失去了5′→3′的外切酶活性。

Klenow片段的主要用途A.B.修补限制性酶消化DNA形成的3′隐蔽末端标记DNA片段的末端C.D.cDNA克隆中第二链cDNA的合成DNA序列的测定GAACTTAA主要用途①3’端补平补平限制性内切酶切后形成的3’隐蔽端。5’

5’

klenowklenow②DNA3’末端标记在3’隐蔽端加上放射性标记的dNTP。3’隐蔽末端的片段Klenow片段补平根据末端的顺序选择一种

-32P-dNTPs末端标记的DNA

限制性内切酶切5’----G3’

3’----CTTAA5’

5’----GAA3’

3’----CTTAA5’

5’----GAATT3’

3’----CTTAA5’

5’----G3’

3’----CCTAG5’

5’----GG3’

3’----CCTAG5’

5’----GGATC3’

3’----CCTAG5’

EcoRIBamHI

-32P-dATP

-32P-dGTP25oC1hmRNAcDNA第一链逆转录cDNA第二链klenowfragment5’

3’

3’

5’

5’

3’

引物③cDNA第二链的合成

T4DNA聚合酶的特点T4DNA聚合酶

从T4噬菌体感染了的大肠杆菌中分离出来的，它和Klenow片段一样具有5′→3′的聚合酶活性和3

′→

5

′的核酸外切酶活性。其外切酶活性要比大肠杆菌聚合酶

I

的活性高200倍。特别是，T4DNA聚合酶还有第三种活力—取代反应：如果反应体系中仅存在一种dNTP，这时T4DNA聚合酶就会表现出3

′→

5

′外切酶活力，从双链DNA的3′开始降解，直到露出和缺乏的那中dNTP互补的碱基，然后就在此位置发生合成和取代反应。CGTCGCGCAGCGCGTGCAGCGMg++dTTPCGGCAGCG

Mg++dTTPT4DNA聚合酶的用途1.以取代反应标记延伸末端（3’末端）或平头末

端的双链DNA片段2.用于DNA序列分析T7DNA聚合酶1000倍

逆转录酶—Reverse

transcriptase逆转录酶是一种可以有效地将mRNA转录成为DNA的酶，其产物称为cDNA(complementary

DNA).实际上，它也是一种RNA依赖的DNA聚合酶。逆转录酶首先是1970年从鼠白血病毒和劳氏肉瘤病毒中发现的。这两个课题组的论文都发在了同一期的《Nature》杂志上。主要用途是

3’

AAAAAAAA将mRNA转录成cDNA以制备基因片段。

5’

TTTTTTTTT

AAAAAAAAAAAAAAAA5’

TTTTTTTTT

TTTTTTTTT3’

AAAAAAAA武汉生物工程学院生物技术系

Taq

DNA聚合