放射性配体与受体结合分析实验(RBA)方法

放射性配体与受体结合分析实验（RBA）方法刘星华2011-5-13药理室讲座内容实验定义与原理实验材料与仪器实验方法Scatchard方程与作图（饱和与竞争实验）RBA的安全问题实验举例实验定义与原理定义放射性配基与受体结合分析简称为受体放射分析（radioassayofreceptors），它是应用放射性核素标记配基与特异受体相结合，研究受体的亲和力和受体的数量，以及研究受体亚型的常用方法。原理放射性标记配基（激动剂或拮抗剂）和组织、细胞，或含有受体的制剂一起温育，使受体和配基充分结合，形成受体-配基复合物，终止反应后，用过滤或离心的方法除去未被结合的标记物，测定滤膜或沉淀物中的放射性，即可计算出和配基结合的受体的量。RBA的分类RBA用放射性核素来标记配基，与相应的受体进行特异性结合反应，可对受体的性质进行定性和定量的分析。1、定性RBA：是通过反应的量效关系的变化来判断受体的类型，单位点或多位点结合式，及受体与配体结合的特点，反应的可逆性、协作性等。2、定量RBA：是在已知配体与受体反应性质的基础上，通过结合反应，给出一定量的组织或细胞中能与该放射性配体结合的受体数及结合的平衡解离常数或结合位点数（最大结合容量）。

实验材料与仪器实验材料动物组织（皮层、海马、纹状体等）仪器（组织匀浆机、旋涡混合器、低温高速离心机、电热恒温水温箱、-80℃冰箱、制冰机、抽虑瓶、液闪仪等）材料（2ml/6ml分离管、10ul/200ul/1ml枪头、微纤维滤纸等）药品（放射性配基、各种非标计化合物等）实验仪器组织匀浆机IKA，T10BS25漩涡混合器WH-2低温高速离心机凯达，TGL20M超低温冰箱海尔数显恒温水浴锅金燕，HH-S26S制冰机GELIN型号IMS-50automaticiceflakes电热恒温水温箱循环水式多用真空泵液闪测定计数仪HIDEX，425-034型实验材料2ml离心管6ml一次性软试管枪头1ml10ul200ulTrisPPO与POPOP过滤装置砂芯过滤装置（抽滤瓶）1000mlWhatmanGF/C玻璃微纤维滤纸40mm放射性化合物放射性配体低温保存实验方法流程实验方法流程1、制备受体样品；2、加样、温育进行结合反应；3、终止反应，分离结合物与游离物4、测定结合物的放射性；5、数据处理。实验具体操作（D1、D2、5-HT）1、配制各种缓冲液及试剂按处方配比配制各种缓冲液贮备液配制各种非标记配体溶液配制各种受试药物溶液注意：该项操作所需试剂或仪器仪器：分析天平、移液枪、烧杯、量筒、容量瓶、试管、EP管等试剂：无水乙醇、超纯水、Tris、抗血酸、优降宁、HCl、NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2、DMSO、甲苯、PPO、POPOP、Methysergide、Butaclamol及5HT等2、制备膜受体大鼠断头取脑分离出目标组织加10倍体积（V/W）冰冷的缓冲液用组织匀浆机匀浆3次，每次数秒钟，制成组织匀浆液组织匀浆液用低温高超离心机离心（12000转/分）3次，每次20分钟弃上清液，沉淀（膜受体）放-80度超低温冰箱保存备用注意：该项操作所需试剂或仪器仪器：手术器械、组织匀浆机、制冰机、超低温冰箱、低温高超离心机试剂：超纯水3、加样

取出膜受体，加入一定体积的冰冷的缓冲液，混匀，使成一定浓度的膜受体溶液。取放射性配体母液，用无水乙醇稀释成实验所需浓度

按以下顺序及比例加入各种反应液。（1）总结合管：100ul膜受体+200ul缓冲液+10ul放射性配体（2）非特异管：100ul膜受体+100ul缓冲液+100ul非标记配体+10ul放射性配体（3）受试物管：100ul膜受体+100ul缓冲液+100ul药物溶液+10ul放射性配体注意：该项操作所需试剂或仪器仪器：移液枪、烧杯、量筒、EP管等试剂：超纯水、无水乙醇、放射性配体母液

4、受体配体结合反应

以上各管在加完放射性配体后，立即放入37度的水浴锅中，孵育20分钟。20分钟后把各管放入冰中终止反应。注意：该项操作所需试剂或仪器仪器：恒温水浴锅，制冰机试剂：无5、分离游离及结合的放射性配体上述各管在反应结束后，分别倒入抽滤装置进行过滤，并用5-10ml冰冷的缓冲液冲洗滤膜2次。滤膜放入85度烘箱中烘干，随后放入测试管中，关加入一定体积的闪烁液，浸泡过夜。注意：该项操作所需试剂或仪器仪器：抽滤器、烘箱、滤纸、移液枪、液闪杯试剂：甲苯、PPO、POPOP6、测定结合型放射配体每分钟放射计数采用放射性计数仪，测定各测试管中结合型放射配体每分钟放射计数注意：该项操作所需试剂或仪器仪器：液闪仪试剂：无7、数据处理按以下公式计算各化合物对同位素配基结合的抑制率百分率：抑制率(I%)=（总结合管cpm—化合物cpm）/（总结合管cpm—非特异结合管cpm）×100%化合物每次实验做两复管，进行两次单独实验。8、各种指标IC50：半数抑制浓度KD：平衡解离常数（mol/L），物理意义为受体有一半结合配基时所需要的配基浓度。Bmax：受体最大结合容量（fmol/mg蛋白质）nH：Hill系数Scatchard方程与作图

（饱和实验）Scatchard方程与作图简单单位点系统受体和配体结合反应（Clark模型）条件：（1）配基与受体结合反应为可逆双分子反应；（2）所有受体都是等效和独立的，同一受体的不同分子对配基的亲和力都相等，而且不受邻近受体分子结合配基与否的影响；（3）配体本身不代谢，也不与其它位置结合；（4）生物效应的强度与浓度近似于总配基浓度。饱和曲线固定的受体数量，固定数量的非标和不同浓度体积的放射性配体饱和曲线(saturationcurve)1）饱和曲线

受体数量一定，当配体（一般是不同浓度体积的放射性配体与固定数量的非标）的浓度从零开始上升时，形成的复合物也逐渐增多。但由于受体数量有限，又是可逆反应，因此[RL]（受体配体复合物）的增加不是直线上升，而是一条上升先快后慢的曲线，最后绝大部分受体与配体结合时，[RL]的增加就非常缓慢，渐趋水平，即受体已经饱和了，此即饱和曲线。#饱和曲线的作用？Scatchard作图，求得KD与Bmax2）曲线的高度取决于[RT]。在曲线起始段，曲线上升的快慢即曲线的斜率取决于配基与受体的亲和力，所以，KD越小(亲和力越大)，饱和曲线上升越快，KD越大(亲和力越小)，饱和曲线上升越慢。（即：亲和力越大，受体与配件结合速度越快，时间越短）

k1,v1[R]+[L]－－－－[RL]k2,v2KD＝K2/K1=[R][L]/[RL]

饱和曲线的形状和KD有关（如图1）。图1KD对饱和曲线的影响

饱和曲线曲线的高度取决于[RT]（如图2）。

图2[RT]对饱和曲线影响质量作用定律(Massactionlaw)：受体和配基的结合反应服从可逆反应的质量作用定律，可用下式表示:

k1,v1[R]+[L]－－－－[RL]（1）k2,v2

上式中，[R]和[L]为游离受体和游离配基的浓度，[RL]为复合物浓度，v1和v2为结合速率和解离速率，k1和k2为结合速率常数(associationrateconstant)和解离速率常数(dissociationrateconstant)。

数学表达根据质量作用定律：v1

=k1[R][L]；v2=k2

[RL]当反应达到平衡后，v1=v2,即:k1[R][L]=k2[RL],则平衡解离常数（KD）的数学表达式为：KD＝K2/K1=[R][L]/[RL]（2）

Scatchard作图

设[LT]为配体的初始浓度，[RT]为受体的初始浓度（即受体总量），则有：[L]=[LT]–[RL][R]=[RT]–[RL]由式（2）整理可得：KD＝[RT-RL][L][RL]

将上式整理可得：

[RL]=[RT]－1_×[RL]（Scatchard方程）[L]KDKD变形：[RL]为受体与配基特异结合的量，换成[B]表示，[L]为自由配基的量，换成[F]表示，[RT]为受体总量，也即受体最大结合量，换成[Bmax]表示，则上式方程变为 B/F=Bmax/KD-B/KD（[RT]为受体总量，等于[R]和[RL]之和，也是最大结合量Bmax）以复合物浓度[RL]为横坐标，以复合物浓度和游离配体的浓度比值[RL]/[L]为纵坐标作图，即为Scatchard作图。图3简单单位点系统RBA的Scatchard作图简单单位点系统Scatchard作图为一条直线，斜率为-（1/KD），横轴截距为[RT]，纵轴截距为[RT]/KD（见图3）。由此求得KD与BmaxHill方程与作图当一个受体分子可以结合一个以上的配基时，配基受体结合反应不是简单的双分子反应，而是

k1,v1[R]+n[L]－－－－n[RL]，根据质量作用定律推导出Hill方程：k2,v2经过变形得其中n为hill系数，以结合分数B/Bmax对游离配基[L]作图，得Hill作图（如右）。（3）将（3）式两边取对数

非特异性结合

(non-specificbinding，NSB)

NSB

在RBA系统中，放射性配体除与受体特异性结合外，还可与其他成分（如非特异蛋白、反应容器、分离材料等）结合。NSB的特点

亲和力小而结合容量大，不易被饱和，随反应系统内配体浓度增加而线性增大，而且这种结合与生物效应无关（见图4）。图4饱和曲线实验中TB、SB和NSB的关系在RBA的数据处理时，测得的总结合的放射性(totalbinding，TB)，必须减去NSB，才能得到特异性结合(specificbinding，SB)的数据。竞争曲线固定的放射性配基浓度，一定量的受体和不同浓度的未标记化合物数学表达此实验用于测定非标计药物与放射性配基竞争结合同一受体的能力。通常用IC50和Ki来表示。闪烁液包括溶剂、闪烁剂和添加剂溶剂：溶解闪烁剂和放射性样品，吸收和传递射线能量。闪烁剂：第一闪烁剂（吸收受激溶剂能量，退激发光）、第二闪烁剂（波长转移，匹配光电倍增管光谱；提高淬灭耐受）添加剂：助溶剂、抗淬灭剂各受体的非标与同位素受体非标放射性配基受体组织5-HT1A5-H