第一周第一节

免疫→标记技术测定袁笑滨医附院检验科病从口入，严格把关！乙肝五项检测HBsAgHBsAbHBeAgHBeAbHBcAb高效！快速！禽畜疫病；真菌毒素；激动剂类；抗生素；其他：三聚氰胺，苏丹红。经典标记技术荧光免疫技术酶免疫技术放射免疫技术三大经典免疫标记技术酶标记技术的催生1941，Coons，荧光标记免疫技术1956，Berson&Yalow，放射标记免疫技术1966年，Nakane&Pierce，“酶标抗体：制备和应用于抗原的定位”20世纪70年代，酶标记检测技术飞速发展酶免疫技术原理及特点抗原抗体反应的特异性+酶高效催化反应的专一性底物

E酶标抗体EE抗原

是以酶标记的抗体（抗原）作为主要试剂，将抗原抗体反应的特异性和酶的高效催化反应的专一性相结合的一种免疫检测技术能定性、定位、定量原理及特点原理：酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应酶对底物的显色反应对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析

特点：灵敏度高、特异性强、准确性好酶标记试剂能够较长时间保持稳定操作简便、对环境没有污染易与其它技术偶联衍生出适用范围更广的新方法克隆酶供体免疫测定酶免疫分析技术酶免疫组织化学技术酶免疫测定技术均相酶免疫测定非均相酶免疫测定酶放大免疫测定技术液相酶免疫测定固相酶免疫测定：酶联免疫吸附试验(ELISA)组织切片或其它标本中抗原的定位分析

液体标本中抗原或抗体的定性和定量酶免疫分析技术分类主要内容第一节酶标记技术第二节酶联免疫吸附实验第三节其他酶免疫测定技术

第四节酶免疫组织化学技术

第五节酶免疫分析技术案例一、酶标记技术（一）酶和酶作用底物（二）酶标记抗体或抗原1.标记酶的特点1.自然界分步广泛，易纯化。2.性质稳定，比活高。3.酶结合物稳定，便于观察和保存实验结果。4.酶催化底物的显色信号易于判断和测量。5.方法敏感，重复性好，简单易行。6.酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉。2.常用于酶免疫技术的酶辣根过氧化物酶（Horseradishperoxidase,HPR）碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase)β–半乳糖苷酶（β-Gal）酸性磷酸酶葡萄糖过氧化酶溶菌酶3.酶和酶作用底物RZ值：403nm（辅基）与275nm（主酶）OD值之比-糖蛋白（主酶）-亚铁血红素（辅基）-主酶与酶活性无关-辅基是酶的活性中心酶活（高比活性）：RZ值与酶活性无关，酶活性单位比RZ值更为重要.底物为H2O2：催化物无色还原型染料生成有色氧化型染料

辣根过氧化物酶3.酶和酶作用底物辣根过氧化物酶（HRP）的底物

DH2+H2O2D+2H2O

HRPH2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很高

供氢体DH2习惯上被称为底物，底物有多种

3.酶和酶作用底物-2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐。---TMB反应后显蓝色，加酸终止反应后变为黄色，测定波长450nm，稳定，无致癌性，ELISA中应用最广泛的底物。---OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长492nm。不稳定，致癌性。辣根过氧化物酶HRP5-氨基水杨酸5-ASA邻苯二胺OPD四甲基联苯胺TMBABTSHRP常用底物3.酶和酶作用底物碱性磷酸酶（AP）β–半乳糖苷酶（β-Gal）性质：磷酸酯水解酶；底物：催化磷酸化合物（单酯、核苷、糖）水解释放磷酸盐，同时生成有色或荧光物质；来源：菌源性AP，肠粘膜AP。底物：β–半乳糖苷，邻硝基酚β–半乳糖苷，乳糖（测葡萄糖含量）；来源：米曲霉。1.3酶和酶作用底物AP的底物β-Gal的底物对-硝基苯磷酸酯（pNPP）：经AP作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405nm。

4-甲基伞酮基β-D半-乳糖苷（4MUG）：酶作用后，生成高强度荧光物，用荧光计测量。底物的选择与使用1.容易获取。2.性质稳定。3.对人的健康没有危害或危害小。4.与相应酶反应后产生肉眼可见的明显变化。5.与相应酶反应时间适中（固相酶免疫，10~30min；酶免疫组织化学，几分钟）。6.与相应酶反应条件不苛刻。底物应具备的特点3酶和酶作用底物酶底物显色反应

测定波长（nm）

辣根过氧化物酶（HRP）邻苯二胺

四甲基联苯胺

氨基水杨酸

2,2‘-胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐

(ABTS)橘红色

黄色

棕色

蓝绿色492460449

642

碱性磷酸酯酶（AP）4-硝基酚磷酸盐(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐黄色

红色400

500葡萄糖氧化酶

ABTS+HRP+葡萄糖

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰黄色

深蓝色405420β-Ｄ－半乳糖苷酶

甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)

硝基酚半乳糖苷(ONPG)荧光

黄色

360,450

420

(二)酶标记抗原或抗体酶标记抗原或抗体酶抗原/抗体通过化学反应或免疫学反应，让酶与抗体或抗原形成的结合物

酶免疫技术的核心组成部分酶结合物（conjugate）酶标记物1.酶标记抗原或抗体条件抗原或抗体制备方法要求抗原要求纯度高，抗原性完整。抗体需要特异性好、效价高、亲合力强以及比活性较高，能批量生产，易纯化。技术方法简单、产率高，重复性好。标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性。酶标记物稳定，不形成聚合物。2.酶标记抗原或抗体方法过碘酸钠法（直接法）

原理：氧化酶分子含糖部分生成醛，醛基与IgG分子结合；特点：标记率高，条件不易控制，引起抗体活性下降常用制备方法

戊二醛交联法原理：两个相同的醛基，可分别与HRP和蛋白质分子中的氨基结合。特点：受酶分子上氨基数限制，产率低一步法二步法3.酶标记抗原或抗体纯化及鉴定标记完成后应除去反应液中的游离酶、游离抗体或抗原、酶聚合物以及抗体或抗原聚合物，避免游离酶增加非特异显色，以及游离抗体或抗原起竞争作用而降低特异性染色强度

常用的纯化方法：葡聚糖凝胶G-200/G-150过柱层析纯化50%饱和硫酸铵沉淀提纯3.酶标记抗原或抗体纯化及鉴定酶标记物的质量鉴定1.生物活性测定：免疫电泳或双向免疫扩散法，出现沉淀线2.酶标记抗体效价和工作浓度测定ELASA和棋盘滴定法3.酶标记率测定分光光度计测定结合物中酶和抗体蛋白的含量4.酶标记物保存酶和抗体均为生物活性物质，易失活。高浓度较为稳定，冻干后可在普通冰箱中保存一年左右。结合物溶液中加入等体积的甘油，加入蛋白保护剂。另外再加入抗生素（例如庆大霉素）和防腐剂（HRP结合物加硫柳泵，AP结合物可加叠氮钠）。一、基本原理底物显色定性或定量的分析包被将已知抗原或抗体吸附在固相载体表面反应加入待测抗体或抗原和酶标抗原或抗体洗涤使结合在固相上的抗原抗体复合物与未结合的分离1234二、方法类型及反应原理（一）检测抗原的方法将己知抗体包被固相载体，待检标本中的相应抗原与固相表面的抗体结合，洗涤去除未结合成分。然后再与抗原特异的酶标抗体结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体复合物，根据加底物后的显色程度确定待检抗原的含量。1.双抗体夹心法（1）夹心法（sandwichELISA）Ab-Ag-AbES显色（+）HBsAb/HBeAbhotdogHBsAg/HBeAgHBsAbE/HBeAbE查抗原

E固相抗体标本（含抗原）酶标抗体EE底物双抗体夹心法检测抗原适用于检测含有至少两个抗原决定簇的多价抗原（1）将已知抗体包被于固相反应板上，洗涤。（2）加待检标本,温育，洗涤。（3）加酶标抗体，洗涤。（4）加底物，根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。2．技术要点

E固相抗体标本（含抗原）酶标抗体EE底物（+）1、已知抗体包被载体3、加酶标抗体4、加酶作用的底物显色2、加待检抗原4、加酶作用的底物不显色洗涤洗涤洗涤洗涤1、已知抗体包被载体2、加待检物（无抗原）3、加酶标抗体（-）YYYYYYEYEYEYYYYYYYYYYEYEYEYYYYYYYEYEYEYYYY洗涤洗涤双抗体夹心法测抗原2.双位点一步法检测抗原

即在双抗体夹心法基础上使用针对抗原分子上两个不同表位的单克隆抗体，分别作为固相抗体和酶标抗体。测定时将待检标本和酶标抗体同时加入进行反应，两种抗体互不干扰，经一次温育和洗涤后，即可加入底物进行显色测定。

EEE底物固相抗体标本（含抗原）酶标抗体双位点一步法检测抗原在包被时使用一种单抗，酶标记时使用一种单抗3.加酶作用的底物显色2.加待检抗原和酶标抗体洗涤1.已知抗体包被载体YYYYEYYEYYYEYYEYY（+）3.加酶作用的底物不显色2.加待检物（无抗原）和酶标抗体洗涤1.已知抗体包被载体YYYYEYYEYY（-）YYY洗涤洗涤双位点一步法测抗原

如果待检标本中抗原浓度过高，容易形成“钩状效应（hookeffect）”。钩状效应严重时，可出现假阴性结果，必要时可将待检标本适当稀释后重新测定。注意事项

EE底物固相抗体标本（抗原浓度高）酶标抗体E3.竞争法检测抗原

酶标抗原和待检抗原对固相特异性抗体具有相同的结合力，二者竞争结合固相特异性抗体。免疫反应后，结合于固相的酶标抗原量与标本中待检抗原含量呈反比。待检抗原量越多，酶标抗原与固相抗体结合越少，底物显色反应越浅；反之则显色越深，即底物显色与待检标本中抗原含量呈反比。

酶标抗原

EEEE固相抗体标本（含抗原）底物E竞争法检测抗原（1）将特异性抗体包被于固相反应板上，洗涤。（2）待测管中加待检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，待检标本中如果含有抗原，则与酶标抗原竞争固结合相抗体，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。对照管中只加酶标抗原，温育，洗涤。（3）加底物显色。对照管中颜色深，待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。技术要点3.加酶作用的底物显色2.加待检抗原和酶标抗原洗涤1.已知抗体包被载体YYYYYY（+）EYYYE3.加酶作用的底物显色2.加待检物（无抗原）和酶标抗原洗涤1.已知抗体包被于载体表面YYYYYY（-）EYYYEEEEEEE洗涤洗涤竞争法测抗原（二）检测抗体的方法将已知抗原吸附于固相载体上，待检标本中相应抗体与之结合，形成固相抗原-抗体复合物，再用酶标二抗与固相免疫复合物中的抗体结合，形成固相抗原-抗体-酶标二抗复合物，根据加底物后的显色程度确定待检抗体含量。1.间接法

固相抗原标本（含抗体）酶标二抗底物EEE间接法检测抗体酶标二抗是针对一类免疫球蛋白(如抗人IgG），因此该法只需要变换固相抗原，即可用一种酶标二抗测各种与抗原相应的抗体，具有更广的通用性4.加酶作用的底物显色2.加待检抗体洗涤1.已知抗原包被载体（+）YYY3.加酶标二抗洗涤YYYYEYEYEYYYYEYEYE4.加酶作用的底物不显色2.加待检物（无抗体）洗涤1.已知抗原包被载体（-）3.加酶标二抗洗涤YEYEYE洗涤洗涤间接法测抗体2.双抗原夹心法

将已知抗原包被固相载体，待检标本中的相应抗体可分别与固相表面的抗原、酶标抗原结合，形成固相抗原-抗体-酶标抗原复合物，根据加底物后的显色程度确定待检抗体含量。同双抗体夹心法。技术要点E固相抗体标本（含抗体）酶标抗原底物EE双抗原夹心法检测抗体4.加酶作用的底物不显色（+）（-）4.加酶作用的底物显色2.加待检抗体洗涤1.已知抗原包被载体3.加酶标抗原洗涤YEYYYYEYEYEYE