第五章 分子生物学研究方法(上)-1

张会勇

生命科学技术学院分子生物学第五章分子生物学研究方法生物科学成为当今世界自然科学的热点和重点，主要由于两方面的原因：

（1）二十世纪后叶，分子生物学等领域一系列突破性成就，使生命科学在自然科学中的地位发生了革命性的变化；

（2）建立在实验室研究基础上的生物技术的发展为人类带来了巨大的利益和财富。生物技术将是未来经济发展的新动力

第一次技术革命 工业革命 解放人的双手 第二次技术革命 信息技术 扩展人的大脑 第三次技术革命 生物技术 改造生命本身

通过生物制造法，生物质可以被转化为生物能源、大宗化学品和精细化合物，从而代替基于石油的化工制造。生物制造的核心技术是构建高效的微生物细胞工厂，从而将生物质原材料转化为各种终端产品。许多传统的欧美化工巨头，如Dupont、Cargill、BASF、Degussa已经逐步在从化工制造向生物制造方向转变。Dupont公司的生物制造已经占到其生产总值的20%。另一方面，近几年来许多中小型生物技术研究公司也迅速成立，如Genencor、Metabolix、Amyris、LS9、Myriant、MetabolicExplorer等。这些研究型公司通过构建高效微生物细胞工厂，开发出很多重要化合物的生物制造技术，如纤维素乙醇、乳酸、丁二酸、聚羟基脂肪酸酯（PHA）、各种氨基酸、1,3-丙二醇等。

早期的微生物发酵产品现在的微生物发酵产品筛选天然的高产菌株通过化学诱变和高效筛选技术来获得提高发酵能力的突变菌株局限性：微生物发酵产物种类非常有限，主要集中在乙醇、丙酮、丁醇、甘油、有机酸、氨基酸和抗生素等代谢物由于大部分微生物的发酵产物都是多种化合物的混合物，因此目标产物的产率通常比较低而下游的分离成本则非常高

基因工程、代谢工程、系统生物学、合成生物学等技术快速发展系统改造微生物的代谢网络构建人工微生物细胞工厂基因操作：主要包括DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因的人工合成、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。

基因工程：指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子中，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。因此，基因工程技术其实是核酸操作技术的一部分

从20世纪中叶开始，分子生物学研究得到高速发展，主要原因之一是研究方法，特别是基因操作和基因工程技术的进步。

基因工程也称为重组DNA技术。严格地说，DNA重组技术并不完全等于基因工程。基因工程是重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。

重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。

1、重组DNA技术2、DNA基本操作技术3、RNA基本操作技术4、SNP的理论与应用5、基因克隆技术6、蛋白质组与蛋白质组学技术本章主要内容：Contents5·1重组DNA技术1.重组DNA技术诞生的理论基础：①遗传物质基础的证明：

40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；②DNA双螺旋结构和功能的阐明：

50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；③遗传信息的流向和表达机制的阐明：

50年代末至60年代，相继提出了"中心法则"和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。④限制性内切酶的发现：

1962年，Arber第一个证明限制性内切核酸酶的存在，1970年，Smith分离到第一种核酸内切限制酶，开始对引起肿瘤的SV40病毒进行研究。应用于DNA图谱和序列分析。

⑤连接酶的发现：1967年世界上5个实验室几乎同时发现了DNA连接酶，1970年Khorana又发现了T4DNA连接酶，它具有更高的连接活性，现广泛应用于DNA操作中。

⑥1970年，Mandel和Higa发现，大肠杆菌经适量氯化钙处理能有效吸收噬菌体DNA。⑦1972年，Cohen等报道氯化钙处理大肠杆菌能摄取质粒DNA。大肠杆菌成为分子克隆中常用的转化受体。基因工程诞生的标志1972年，斯坦福大学，P.Berg小组，世界首例DNA体外重组。

SV40/EcoRⅠ+λDNA/EcoRⅠ

↓recombinantDNA1973年，斯坦福大学，S.Cohen小组，体外重组并转化成功。

R6-5（KanR）/EcoRⅠ+pSC101（TetR）/EcoRⅠ

↓recombinantDNA

↓

转化菌（双抗）基因工程的诞生

（一九七三年）

综合S.Cohen和P.Berg创造性的研究成果，“在细胞外，把目的核酸分子与载体核酸分子组合成新的遗传物质，再把它导入原本没有这种物质的细胞内，并使这种重组遗传物质在细胞内的无性繁殖获得成功”，这一工作内容定义为基础工程，世界上第一次完成这项工作内容的1973年被公认为基因工程诞生的元年。1.目的基因的获得2.目的基因与载体的连接3.重组DNA分子导入受体细胞4.筛选出含重组DNA基因分子的受体细胞克隆5.对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物基因工程技术的基本步骤切接转增检重组DNA技术的四大要素①外源基因；②工具酶；③载体；④受体细胞。

●核酸内切限制酶，是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。EcoRIHindIII

●DNA连接酶

——基因工程的缝纫针

功能：将两条双链DNA片段连接起来，实现DNA的体外重组。图5-2DNA连接酶能把不同的DNA片段连接成一个整体

●主要载体系统载体：凡来源于质粒或噬菌体的DNA分子，可以供插入或克隆目的基因DNA并具有传递运载外源DNA导入宿主细胞能力的片段统称为载体。这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。理想载体的基本条件1、能自我复制并能带动插入的外源基因一起复制。2、具有合适的多种限制酶的单一切点，可插入一段较大的外源DNA，而不影响其本身的复制；3、具有适宜的筛选标记。例如抗药性标记，蓝白斑试验；4、相对分子质量小，细胞内拷贝数要多。5、在细胞内稳定性高，易分离纯化。根据质粒载体的用途进行分类克隆载体(cloningvector)指使插入的外源DNA序列被扩增为目的，并不需要得到目的基因所编码蛋白质的载体。表达载体(expressionvector)能使外源目的基因在宿主细胞中转录和表达的功能性载体常见的克隆载体质粒载体（plasmidvectors）λ噬菌体载体（λphagevectors）柯斯质粒载体（cosmidvectors）M13噬菌体载体（M13phagevectors）噬菌粒载体、YAC、BAC：高容量载体质粒克隆载体质粒—染色体外能自主复制的共价双链闭合环状DNA分子，广泛存在于原核细胞内。质粒DNA的构型：

1.共价闭合环状（covalentlyclosedcircularDNA,CCC）或超螺旋构型（SC）2.开环构型（opencircular,OC）3.线性构型（linear,L）电泳迁移率：

SCDNA>LDNA>OCDNA质粒载体

的一般结构表达载体(expressingvector)特点：带表达构件—转录和翻译所需的DNA序列大肠杆菌表达载体：含启动子—核糖体结合位点—克隆位点—转录终止信号启动子：trp-lac(tac)启动子、λ噬菌体PL启动子、T7噬菌体启动子核糖体结合位点(ribosome-bindingsite,RBS)：起始密码子(ATG)和SD序列转录终止序列宿主菌或受体细胞大肠杆菌酵母昆虫细胞哺乳动物细胞导入重组体主要方法

转化（作用）（transformation）转染（作用）（transfection）电转化法（electrotransfortion）

(电穿孔术electroporation)微注射技术（microinjection）基因枪技术（geneblastertechnique）脂质体介导法（liposomemediatedgenetransfer）(插入失活法)抗药性标记选择

如：pUC118质粒的多克隆位点整合在lacZ基因中，该位点如果没有插入外源目的基因，lacZ基因便可表达出

半乳糖苷酶，如果平板培养基中含有IPTG（乳糖操纵子的诱导物）和X-gal（

半乳糖苷酶的底物）便会被

半乳糖苷酶水解成蓝色，大肠杆菌形成蓝色克隆。在多克隆位点插入外源目的基因，破坏了lacZ基因的结构，大肠杆菌形成白色的克隆

利用lacZ基因的插入失活筛选重组质粒

X-gal蓝色化合物

-半乳糖苷酶Lac-Z基因蓝白斑筛选酶切鉴定

用抗生素筛选、蓝白筛选等方法筛选出的菌落需进一步进行酶切分析，鉴定插入片段的大小和插入方向。（1）

插入片段大小的鉴定（2）插入片段方向性的鉴定重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源基因）基因组DNAcDNA人工合成PCR产物限制酶消化

载体DNA目的基因连接酶重组体转化体外包装，转染带重组体的宿主筛选表型筛选酶切电泳鉴定菌落原位杂交

一般克隆基因的检查和鉴定方法琼脂糖凝胶电泳分离鉴定大小不等的酶解片段：磷酸基团带负电荷酶解片段向阳极移动

酶切、电泳方法Contents1、重组DNA技术2、DNA基本操作技术3、RNA基本操作技术4、SNP的理论与应用5、基因克隆技术6、蛋白质组与蛋白质组学技术5·2DNA基本操作技术5.2.1凝胶电泳(gelelectrophoresis)5·2·2细菌转化5.2.3PCR技术5.2.4实时定量PCR5.2.5基因组DNA文库构建5.2.1凝胶电泳(gelelectrophoresis)自从琼脂糖(agarose)和聚丙烯酰胺(po1yacrylamide)凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段。同时也是现在通用的许多分子生物学研究方法。DNA在中性或偏碱性的缓冲系统中带负电，把DNA分子放置在电场当中，它们就会向正电极的方向迁移。核酸的凝胶电泳基本原理：在一定电场强度下，DNA分子的迁移速度，取决于核酸分子本身的大小、所带净电荷多少和构型。琼脂糖凝胶电泳：70bp-50kbDNA聚丙烯酰胺凝胶：<1kbDNA脉冲场凝胶电泳：上百万bpDNA核酸的凝胶电泳种类称样溶解加热电泳操作基本程序侧视俯视制板倒胶样品制备DNA样品每条带>100ng上样缓冲液

50%甘油/蔗糖

0.5%溴酚蓝/二甲苯青

电泳紫外灯下显色电泳染色

溴化乙锭(ethidiumbromide,EB)

结构及染色原理溴化乙锭（EB）是一种具扁平分子的核酸染料，可插入DNA或RNA分子的碱基之间，并在300纳米波长的紫外光下放射出荧光，指示出凝胶介质中DNA谱带的位置；而在适当染色条件下，电泳谱带的荧光强度是同DNA片段的大小成正比的。紫外灯下显色凝胶成像系统Mmarker1.2普通Taq酶3.4hotstartTaq酶染色方法电泳前加入凝胶介质中

电泳结束后，含有DNA分子的凝胶浸泡在溴化乙锭（EB）的溶液中染色3.聚丙烯酰胺凝胶电泳

polyacrylamide

gel

electrophoresis

（PAGE）以聚丙烯酰胺为支持物，常用垂直板电泳。适于分离10bp~1000bp的DNA、RNA片段或蛋白质。凝胶浓度3%~20%。聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)4.脉冲电场凝胶电泳(pulsed-fieldgelelectrophoresis，简称PFGE)

分离50kb超大分子量的DNA分子PFGE施加在凝胶上至少有两个电场方向，时间与电流大小也交替改变，使得DNA分子能够不断地调整泳动方向，以适应凝胶中不规则的孔隙变化，达到分离大分子线性DNA的目的。图5-4DNA脉冲电场凝胶电泳示意图5·2·2细菌转化

细菌转化：所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。这种提供转化DNA的菌株叫做供体菌株，而接受转化DNA的寄主菌株则称做受体菌株。常用的细菌转化方法：CaCl2法和电击法5·2常见DNA操作技术导入重组体主要方法

转化（作用）（transformation）转染（作用）（transfection）电转化法（electrotransfortion）

(电穿孔术electroporation)微注射技术（microinjection）基因枪技术（geneblastertechnique）脂质体介导法（liposomemediatedgenetransfer）重组DNA分子导入大肠杆菌转化：以质粒DNA或以它为载体构建重组质粒DNA导入细胞，而使细胞的遗传学发生改变的过程。转染：将温和的噬菌体、病毒或以它为载体构建的重组子，体外包装成具有感染性的病毒颗粒直接导入受体细胞中的过程。Ca2+与细菌细胞膜磷脂层在低温（0℃）下形成液晶结构，后者经热刺激（42℃）发生收缩作用，使细胞膜出现许多间隙，为DNA分子提供了进入细胞的通道。Ca2+诱导大肠杆菌转化法/氯化钙转化法1、制备感受态细胞2、DNA分子转化感受态细胞感受态细胞：为提高效率，可对受体菌进行物理或化学处理，增加其获取DNA的能力。经过这种处理的细胞被称作感受态细胞（competentcells）。制备感受态细胞大肠杆菌载体0℃CaCl2选择性培养基上培养筛选阳性克隆得到大量目的基因CaCl2法选择性培养基上培养噬菌体作载体将DNA注入到寄主细胞中的方法插入型替换型限制性内切酶切割加入外源DNADNA连接酶连接噬菌体外壳蛋白包装感染细菌通过受体蛋白将外源DNA注入宿主细胞内电穿孔法电脉冲可以在细胞膜上造成小凹陷，形成疏水孔洞。随着跨膜电压增加，大疏水性孔洞会转变为亲水性孔洞，介质中的DNA进入细胞质。将生长至对数中期的E.coli菌液冷却至4℃后离心，洗菌后用10%的甘油悬浮，将高密度菌液（~2×1010/ml）置于特制的电极杯中进行电击。5.2.3PCR技术

聚合酶链式反应

(PolymeraseChainReaction)是根据DNA半保留复制和DNA聚合酶的特性建立起来的体外复制扩增DNA片段的技术这是一种体外快速扩增特定基因或DNA片段的技术。PCR技术具有极高的灵敏度，用1个细胞、1个孢子、1根头发、1个精子的DNA为模板，就可扩增得到大量目标DNA序列，可为生物工程、疾病诊断、法医鉴定和古生物研究提供令人瞠目的原始材料。2003年9月28日，沈阳市沈河区发生了一起凶杀案，在案发现场发现的烟灰缸中有一个可疑的烟头。法医从这个烟头中提取了微量的DNA，但由于DNA含量太低，无法确定嫌疑犯的DNA特征。他们利用DNA体外扩增技术，将样品DNA大量扩增，准确分析出嫌疑犯的DNA特征，并以此为依据迅速找到了杀人凶手。该技术是现代分子生物学研究中一项富有革新性的创举，美国“Science”杂志评为1989年度十大科技新闻之一，Mullis博士也因发明这一方法荣获1993年度诺贝尔化学奖。1972年，穆里斯在美国加州大学伯克利分校取得有机合成专业博士学位

。1979年进入西特斯生物技术公司任职，负责合成供实验用的短链DNA分子。(Perkin-ElmerCetusCorporation)。

逶迤崎岖的山路——DNA双螺旋行驶的汽车——一小段DNA引物……

从1983年9月起，穆里斯陆续进行了一些实验，换过几个DNA模板，也尝试不同的加热、降温周期。在这年底（12月16日第一次成功实验）发明了PCR。1984年11月，在三位技术员协助下，穆里斯的PCR实验取得可信的结果。1985年12月20日，第一篇关于PCR的论文，发表在《科学》周刊上。(R.Saiki,S.Scharf,F.Faloona,K.Mullis,G.Horn,H.ErlichandN.Arnheim)在“人类分子生物学”专题研讨会上，穆里斯做了PCR原理及实验应用的报告。

Mullis初期的实验是运用大肠杆菌DNA聚合酶的Klenowfragment催化反应，这个做法不但烦琐，并且非常昂贵。1986年6月，西特斯公司的技术人员首次将耐高温DNA聚合酶应用于PCR过程，不仅大大简化了PCR操作程序，同时专一性及活性都比以前使用的酶更强。至此，PCR技术取得了完全的成功。美国黄石国家公园温泉TaqDNA聚合酶于1988年saiki从嗜热水生菌thermusaquaticsYT-1株中直接分离出来。该菌株于1969年从美国黄石国家森林公园火山温泉中分离到。PCR仪和方法很快风行于生命科学相关的众多领域和产业，此时DuPont杜邦公司也生产PCR仪，并看好PCR技术的广宽的市场前景，所以向当时还是小公司的塞特斯公司发难，提出诉讼。认为此专利权应授于诺贝尔奖的得主柯勒纳，因他在1971年即发表了PCR技术的机理、方法，并提出了论文和科研基金申请书等物证。

专利官司1971年美国麻省理工MIT教授、1968年诺贝尔医学奖得主Khorana提出“经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。核酸体外扩增最早设想并没有引起足够重视，当时很难进行测序和合成寡核苷酸引物；

1989年，大小公司对簿公堂，将决定谁将获得诺贝尔奖。争论和审理了数月，旧金山地方法院判决杜邦公司败诉。Cetus公司获得PCR基本技术专利。Cetus获胜后马上反诉，指出DuPont已侵犯另一项与PCR有关的专利并要求对方赔偿以及不再销售与PCR有关试剂和仪器。Mullis与Cetus公司分道扬镳时，只获得了5个月的薪水和10000美元奖金，专利权按业界的惯例留给了Cetus公司，而后者以3亿美元的天价买给了药业巨头Roche.

聚合酶链式反应（PCR）三步曲：变性、退火、延伸将双链DNA分子在临近沸点的温度下加热分离成两条单链DNA分子，DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸合成新生的DNA互补链。

3、PCR的反应体系和方法

总体积50-100lBuffer

缓冲液

dNTP原料

Primer引物

DNA分子模板

Taq酶DNA聚合酶

1）反应体系5

EssentialComponentsofPCRReaction

salts(ions)dNTPsPrimersDNAPolymeraseTemplateDNA待扩增的DNA片段+dNTP+Tris·HCl缓冲液+两条引物+TaqDNA聚合酶+Mg2+95℃变性30″60℃退火30″72℃延伸1′

双链DNA变性，形成单链模板DNA；使引物与两条单链模板DNA发生退火作用并结合在靶DNA区段两端的互补序列位置上在DNA聚合酶的作用下，从引物的3′-端加入脱氧核苷三磷酸，并沿着模板按5′→3′方向延伸，合成新生DNA互补链。25～302）PCR全过程3’5’PCR基本原理：变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA5’3’5’3’变性5’3’退火：当温度突然降低时，反应体系中引物和其互补的DNA模板在特定互补部位相配对，局部形成杂交链退火3’5’3’5’5’3’3’5’P1P2延伸3’5’3’5’5’3’3’5’P1P2延伸：在DNA聚合酶和4种脱氧核苷酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）及Mg2+存在条件下，5’→3’的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应再变性再退火P1P1P2P2P1P1P2P2再延伸PCR的基本反应步骤变性95˚C延伸72˚C退火Tm-65˚CPCR扩增能力是十分惊人的，经n次扩增后,一个DNA分子可变为2n个DNA分子。理论上讲经过30次循环反应，便可使靶DNA得到109倍的扩增，但实际上大约是106～107倍的扩增，即便反应混合物中只含有一个拷贝的靶DNA，也能被有效的扩增，因此可用于痕量DNA样品的分析，这对于法医学具有特别的应用价值。PCR仪PCR琼脂糖凝胶电泳最终产物紫外光观察PCR的基本步骤设计一对引物以便有效扩增所需要的DNA序列。优化反应体系：缓冲液、待扩增的模板、dNTP

、Mg2+

、引物、耐热DNA聚合酶。变性（denatur