第五章蛋白质的化学修饰

目前为止尽管人类已经发现了数千种酶,但是真正具有商业价值即每年销售额可超过1000万美元的酶不过数十种。第五章蛋白质的化学修饰蛋白质化学修饰的应用提高蛋白质的稳定性：温度，pH值，离子强度蛋白质活性的改变：专一性，催化活性确定氨基酸残基的功能应用于蛋白质免疫化学：嵌合抗体和人缘化抗体应用于研究蛋白质的一级结构、高级结构应用于生产实际：疫苗制备，丝绸、羊毛染色第五章蛋白质的化学修饰第一节蛋白质的化学修饰第二节酶分子的化学修饰第一节蛋白质的化学修饰蛋白质侧链的化学修饰蛋白质肽链的化学修饰1、氨基的化学修饰

三硝基苯磺酸与赖氨酸残基反应，在420nm和367nm能够产生特定的光吸收。亚氨代乙酰基：亚氨代乙酰化反应可区分α-氨基和ε-氨基。完全亚氨代乙酰化的蛋白质仍保持在水溶液中的可溶性。α-异硫氰酸苯酯在严格控制的条件下可对α-氨基进行相当特异性的修饰，而不作用于ε-氨基。一、蛋白质侧链的化学修饰蛋白质分子中的谷氨酸和天冬氨酸的修饰方法很有限，产物一般是酯类或酰胺类。水溶性的碳化二亚胺类特定修饰羧基基团，可在较温和的条件进行2、羧基的化学修饰

一、蛋白质侧链的化学修饰二硫键的还原：巯基乙醇、巯基乙酸和二硫苏糖醇等。判断蛋白质分子中有无二硫键，是链内二硫键还是链间二硫键的方法可用非还原/还原双向SDS电泳技术。处理后的蛋白很容易自动氧化，重新形成二硫键，因而需要经过羧甲基处理，防止重新形成二硫键。5，5’二硫-2-硝基苯甲酸（DTNB）（Ellman试剂），可与巯基反应形成二硫键，使蛋白质分子上标记1个2-硝基-5-硫苯甲酸（TNB），同时释放1个有很强颜色的TNB阴离子，可在412nm处通过光吸收的变化来监测反应的程度。Ellman是目前常用的定量测定蛋白质分子巯基数目试剂，还被用于探测蛋白质分子去折叠与再折叠时的构象变化状态及跟踪构象变化的过程。3、氧化还原修饰

一、蛋白质侧链的化学修饰温和的反应条件是防止蛋白质分子变性的一个必要条件pH值的变化：决定了具有潜在反应能力的基团所处的可反应和不可反应的离子状态。温度：影响活性巯基的微环境有机溶剂：试剂需要有机溶剂来助溶，但有机溶剂可使蛋白质变性。4、影响侧链化学修饰的条件

一、蛋白质侧链的化学修饰

产生半合成的结构，一个天然多肽与一个人造（或化学修饰）的多肽相缔合非共价缔合产生二硫键形成肽键产生非天然型的共价键二、蛋白质肽链的化学修饰非共价缔合在多肽链中如果出现一个切口，但多肽链并不因此分开，仍能保持其生物学活性。在变性系统中，破坏非共价键后，在非变性基质中仍可形成原来的构型，活力也随之恢复。这一现象可用来产生半合成的类似物产生二硫键二硫键被还原剂打开，多肽彼此分开DTT、二硫苏糖醇将这些片断与适当的被修饰的或合成的另一肽相混合，通过重新形成二硫键而形成嵌合分子形成肽键通过酶连接反应形成肽键从猪胰岛素生产人胰岛素将B链丙氨酸残基改为苏氨酸残基（胰蛋白酶）

通过酶法与活性酯偶联羟基琥珀酰亚胺酯作为接头分子产生非天然型共价键利用双功能试剂可以将不同的蛋白质连在一起。常用的方法是将双功能的接头与两个蛋白质分子中的赖氨酸残基侧链相连接。可以用主链肟键产生尾-尾相连二聚体第二节酶分子的化学修饰酶的活性中心酶化学修饰的目的酶化学修饰的原理酶化学修饰的设计酶化学修饰的应用一、酶的活性中心（activesite）

（一）活性中心的概念酶的必需基团(essentialgroup):

与酶活性有关的基团酶的活性中心(activecenter):

由必需基团构成的与酶催化活性有关的特定区域.

酶分子非必需基团必需基团活性中心必需基团活性中心外必需基团结合基团催化基团非活性中心活性中心活性中心的重要化学基团7种氨基酸出现的频率最高LysAspGluCysHisTyrSer（兰天果拌猪肉丝）某些功能基团,如（氨基、羧基、巯基、羟基和咪唑基）是酶的必需基团。赖氨酸的氨基天冬氨酸和谷氨酸的羧基半胱氨酸的巯基组氨酸的咪唑基酪氨酸和丝氨酸的羟基（二）活性中心的共性(1)活性部位只占酶分子很小的一部分（1-2%）(2)活性部位是一个三维实体。(3)活性中心位于酶分子表面的疏水性裂缝中。(4)活性中心构象不是固定不变的（诱导契合）(5)酶与底物通过盐键、氢键、范德华力和疏水作用等次级键结合。（三）研究酶活性中心的方法

1.物理学方法：用X射线衍射法直接检测底物或其类似物与酶形成的中间复合物（包括酶和底物）的相对位置。2.化学修饰法：根据所用修饰试剂不同，分为

1)非专一性化学修饰

用非专一性的修饰试剂与氨基酸侧链基团作用。若某基团被修饰后：

酶活性不变——该基团可能不是酶的必需基团酶活性降低或丧失——该基团可能是酶的必需基团但不能确定化学试剂是同活性中心内的必需基团结合。活性中心基团的鉴定标准①失活程度与修饰剂浓度成一定比例关系。②S或可逆抑制剂有保护作用（活性中心）。先加S或竞Ⅰ加共价修饰剂透析除去S或竞Ⅰ活性不丧失差别标记：底物或抑制剂存在活性基团不与修饰剂作用去除底物或抑制剂原来被保护的基团带同位素标记可直接得到蛋白质发挥功能作用的必需基团。化学修饰含同位素标记的同样试剂2)专一性化学修饰（基团专一性修饰）用专一性化学修饰剂修饰酶活性中心的某一氨基酸残基的侧链基团。3)亲和标记（位点专一性修饰）采用的修饰试剂是根据底物的化学结构设计合成的含有活泼反应基团的底物类似物。作用机制：利用酶对底物的特殊亲和力将酶加以修饰标记。化学修饰的专一性亲和修饰剂：

①与S结构相似，与活性中心的氨基酸残基亲和力大，而与活性中心以外的氨基酸残基亲和力小。②具有活泼的化学基团（如卤素）可与活性中心的基团形成稳定的共价键。3.蛋白质工程：将酶相应的cDNA定点突变，突变的cDNA只表达一个或几个氨基酸被置换的酶蛋白，测定其活性可知被置换的氨基酸是否为活力所必需。二、酶化学修饰及修饰目的（一）酶化学修饰1.限制酶大规模应用的原因： 1)细胞外稳定性差； 2)酶活性不够高； 3)具有抗原性。

2.改变酶特性有两种主要的方法：1)通过分子修饰的方法来改变已分离出来的天然酶的活性。2)通过基因工程方法改变编码酶分子的基因而达到改造酶的目的。3.酶化学修饰的概念酶的化学修饰（chemicalmodification）：通过化学基团的引入或除去，使蛋白质共价结构发生改变。酶选择性化学修饰：描述肽链侧链基团被化学试剂专一性地修饰。（二）酶化学修饰的目的1.研究酶的结构与功能的关系。（50年代末）2.人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用范围。（70年代末之后）1）提高酶的生物活性（酶活力）。2）增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）。3）消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能力）。4）产生新的催化能力。

三、酶化学修饰的原理（一）如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性

修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶形成多点交联。使酶的天然构象产生“刚性”结构。（二）如何保护酶活性部位与抗抑制剂大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖”了酶的活性部位。（三）如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶：1.大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶接近酶分子。“遮盖”酶分子上敏感键免遭破坏。2.酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减少了受蛋白水解酶破坏的可能性。（四）如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境1.酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成了共价键。破坏了抗原决定簇——抗原性降低乃至消除“遮盖”了抗原决定簇——阻碍抗原、抗体结合2.大分子修饰剂本身是多聚电荷体，能在酶分子表面形成“缓冲外壳”，抵御外界环境的极性变化，维持酶活性部位微环境相对稳定。

四、酶化学修饰的设计

（一）充分认识酶分子的特性

包括酶的——1.活性部位情况2.稳定条件及反应最佳条件3.侧链基团的化学性质及反应活泼性（二）修饰剂的选择

要考虑——

1.修饰剂的分子量及链的长度（要求有较大的分子量）2.修饰剂上反应基团的数目及位置（要求有较多的反应活性基团）3.修饰剂上反应基团的活化方法与条件（三）反应条件的选择

要注意——1.酶与修饰剂的分子比例2.反应体系的溶剂性质、盐浓度、pH条件3.反应温度及时间五、酶化学修饰的种类及应用

（一）酶的表面化学修饰

1.大分子修饰（大分子结合修饰）是目前应用最广的酶分子修饰方法。

（1）定义：利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法。（2）修饰剂：聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐（dextran）、肝素（heparin）、蔗糖聚合物（Ficoll）等。修饰方法：修饰前活化，然后在一定条件下与酶分子共价结合。（3）应用：如：PEG－超氧化物歧化酶（SOD）PEG－溶血类蛋白质（链激酶、尿激酶等）PEG－天门冬酰胺酶（ASNase）

消除了抗原性延长了酶在体内的半衰期又如：用Dextran修饰

-淀粉酶，－淀粉酶，胰蛋白酶、过氧化氢酶，提高了酶的热稳定性。2.小分子修饰（酶蛋白侧链基团修饰）定义：通过选择性的试剂或亲和标记试剂与酶分子侧链上特定的功能基团发生化学反应。侧链基团：组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。主要有：氨基、羧基、胍基、巯基、酚基、咪唑基。侧链基团修饰剂：采用各种小分子化合物。

20种不同氨基酸的侧链基团中只有极性氨基酸的侧链易被修饰，它们一般具有亲核性。根据氨基酸侧链R基的极性，20种氨基酸可分成4类。

（1）非极性R基氨基酸（共8种）：丙氨酸(Alanine,Ala,A),亮氨酸(Leucine,Leu,L),缬氨酸(Valine,Val,V)),异亮氨酸(Isoleucine,Ile,I),苯丙氨酸(Phenylalanine,Phe,F),色氨酸(Tryptophan,Trp,W),甲硫氨酸(Methionine,Met,M),脯氨酸(Proline,Pro,P)（2）无电荷的极性R基氨基酸（共7种）：丝氨酸(Serine,Ser,S),苏氨酸(Threonine,Thr,T),酪氨酸(Tyrosine,Tyr,Y),半胱氨酸(Cysteine,Cys,C),天冬酰胺(Asparagine,Asn,N),甘氨酸(Glycine,Gly,G),谷氨酰胺(Glutamine,Gln,Q)（3）带正电荷的极性R基氨基酸（共3种）：赖氨酸(Lysine,Lys,K),精氨酸(Arginine,Arg,R),组氨酸(Histidine,His,H)（4）带负电荷的极性R基氨基酸（共2种）：天冬氨酸(Asparticacid,Asp,D),谷氨酸(Glutamicacid,Glu,E)几种重要的修饰反应：烷基化反应酰化反应氧化还原反应芳香环取代反应化学修饰反应的类型：

1)烷基化反应试剂特点：烷基上带活泼卤素，导致酶分子的亲核基团（如－NH2，-SH等）发生烷基化。可作用基团：氨基（Lys，Arg），巯基（Cys），羧基（Asp、Glu），甲硫基（Met），咪唑基（His）。修饰剂：2，4－二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺等。烷基化反应

2)酰基化反应试剂特点：含有结构，作用于侧链基团上的亲核基团，使之酰基化。可作用基团：氨基，巯基，醇羟基（Ser、Thr），酚羟基（Tyr）酰基化反应

3)氧化和还原反应试剂特点：具有氧化性或还原性。氧化剂：H2O2，N-溴代琥珀酰亚胺可被氧化的侧链基团：巯基，甲硫基，吲哚基（Trp）、咪唑基，酚基等。还原剂：2－巯基乙醇、DTT等。可被还原的侧链基团：二硫键。连四硫酸盐氧化巯基，DTT还原逆回，用于保护巯基。

4)芳香环取代反应试剂：卤（碘）化，硝化试剂。碘代：

I2＋

+HI

硝化：

(NO2)4C+

+(NO2)3CH

（四硝基甲烷