AFLP实验操作指南

AFLP试验操作指南试验操作流程DNA样本的准备把DNA样本用紫外光（或荧光）分光光度计精确的测取浓度，然后将其稀释成浓度为50ng/ul，体积为50ul的溶液，假如DNA样本不多，在保证浓度的状况下体积可以合适减少。DNA酶切反应体系成分体积（ul）双蒸水11.0缓冲液（Yellowbuffer）4EcoRI(10u/ul)0.3MseⅠ(10u/ul)0.5BSA0.2模板DNA（50ng/ul）4总体积20反应程序37℃反应3个小时，然后65℃反应3个小时，最终保留于检测取4－6ul酶切液进行酶切效果检测，跑出的带以弥散状、无明显主带为好。连接接头接头的制备按企业阐明书将引物单链稀释成高浓度(一般是5OD稀释成1650ng/ul)溶液储存于－20℃取部分引物单链稀释成100uM/l，然后两条正反单链混合，体积例如下：10ulEcoR1正链、10ulEcoR1反链和180ulTE混合成200ulEcoR1接头；100ulTruI1正链、100ulTruI1反链混合成200ulTruI1接头。c、反应程序：95℃下5min，65℃下10min，37℃下10min，25℃下10min，保留于4连接反应体系成分体积（ul）双蒸水7.6反应缓冲液（T4DNA连接酶自带）2.5EcoR1接头1TruI1接头1T4DNA连接酶（5u/ul）0.4酶切反应后溶液12.5总体积25反应程序20℃保留过夜。稀释按1：10的比列稀释，已稀释的和未稀释的均可长时间储存于－20℃备用。试验进行到此处可以停止预扩增反应体系成分体积（ul）双蒸水9.7缓冲液（10xTag酶自带）2dNTPs(10Mm0.4EA00(50ng/ul)0.8MC00(50ng/ul)0.8Tag聚合酶（5u/ul）0.1稀释后已连接DNA模板5MgCl2(25mM1.2总体积20反应程序a、94℃b、94℃c、56℃d、72℃e、反复b～d25次f、72℃g、保留于4稀释取部分预扩增后溶液按1：25的比列稀释。将已稀释的和未稀释的保留于－20℃储存。试验进行到此处可以停止检测取未稀释的预扩增液4－6ul进行琼脂糖电泳检测。选择扩增反应体系成分体积（ul）双蒸水1.55缓冲液（10xTag酶自带）1dNTPs(10Mm/l0.225EA--(10ng/ul)*2MC--(10ng/ul)*2Tag聚合酶（5u/ul）0.125MgCl2(25mM/l)(Tag酶自带)0.6预扩增稀释后模板2.5总体积10*:EA--,MC—背面两个碱基因不一样引物对而不一样。（2）反应程序a、第1个循环：94℃4min,94℃30s,65℃b、第2～13个循环：94℃30s,65℃1min,72℃1min（退火温度每隔一种循环减少c、第14～36个循环：94℃30s,56℃1min,d、72℃5min,46．变性（1）变性剂（Loadingbuffer）配方组分体积去离子甲酰胺（DeionizedFormamide）50mlEDTA(0.5MPH=8.0)1ml二甲苯青FF(XyleneCyanoleFF)0.125g溴酚蓝（BromphenolBlue）0.125g变性将7.5ul变性剂加入PCR反应产物，95℃7.制胶溶液（1）一块胶的配方将12ml5XTBE和27g尿素（Urea）混合加水定容至51ml，向其中加入9ml40％的丙烯酰胺溶液，400ul10%过硫酸胺（APS）和30ul四甲基一二胺（TEMED）。（2）各组分派方5XTBE：54gTris碱（Tris-base）,27.5g硼酸（B-acid）和20mlEDTA(0.5M,PH=8.0)混合定容至1000ml。40％丙烯酰胺溶液：2g甲叉丙烯酰胺（N、N-MethyleneBisacrylamide）,38g丙烯酰胺（Acrylamide）混合加水定容至100ml。10％过硫酸胺溶液：1g过硫酸胺（APS）加水定容至10ml。8.亲水和疏水处理及灌胶（1）长玻璃（亲水玻璃）处理：a、亲水剂制备：2ml95%酒精，4ul亲水硅烷（BindingSilane）,10ul冰醋酸混合。此为一块板用量。b、洗净玻璃板，以水沿玻璃板均匀下流为好。c、用手巾纸浸亲水剂涂搽玻璃板。d、干燥5分钟，用约2ml95％的酒精再轻轻涂搽玻璃板（以均一方向）然后在垂直向再涂搽一遍。e、晾干约十分钟。（2）短玻璃（疏水玻璃）处理a、换手套，以防亲水剂和疏水剂交叉污染。假如出现污染状况，可将玻璃浸入10％的NaOH溶液中。b、洗净玻璃板，以水沿玻璃板均匀下流为好。c、用纸巾浸疏水剂(Repel-silaneES)涂搽玻璃板，要均匀。d、干燥5分钟，用约2ml95％的酒精再轻轻涂搽玻璃板（以均一方向）然后在垂直向再涂搽一遍。e、晾干约十分钟。f、疏水处理做一次大概可以跑5块胶再做或当出现轻微扯胶状况时再做。（3）将长玻璃放在水平的泡沫垫上，亲水面向上，将两个胶条平行分置于其较长的两边，然后轻轻放上疏水玻璃，疏水面向下。这样在两玻璃间形成了一种矩形空隙。用夹子夹住固定。（4）用胶带将左右两边和底边封上，留出插梳子的边（有凹边的那一边），封时要均匀不留气泡。（5）将梳子插入有凹边的缝隙，看与否轻易均匀，不行要合适调整。（6）将有凹边的那边稍稍垫高，然后配胶用注射器筒灌入，要从一边均匀灌入，胶中不留气泡。（7）将梳子平直边插入凹口缝隙，以形成一种胶的平直端。注意其端线应与玻璃板的长边垂直。（8）让胶至少聚合两个小时。9.电泳（1）将电泳槽底盒装入400ml1XTBE缓冲液，上盒装入500ml1XTBE缓冲液。（2）轻轻拔掉梳子，固定玻璃于电泳仪上，到入上盒缓冲液，用1000ul枪冲洗凹口缝隙，冲洁净为好，65W预电泳30min。（3）预电泳完毕断开电源，再次冲洗缝隙，然后将梳子齿端插入凹口缝隙，其齿尖端轻轻的插进胶中，以构成点样孔。（4）点入3.0～4.5ul变性后的样品。（5）65W电泳约两个半小时，直到上边那条浅蓝色的指示带到离顶端2/3为好。（6）电泳完毕，分开两玻璃板，将固着胶的亲水板放入预先准备好的10％的醋酸固定液中浸泡固定脱色。10.银染（1）脱色：2升10％冰醋酸溶液（固定/停止液），轻轻摇20分钟至所有脱色。附10%冰醋酸配方：200ml冰醋酸与1800ml双蒸水混合。（2）冲洗：用双蒸水漂洗三次，每次5分钟。（3）染色：加染色液，染色20～30分钟。附染色液配方（用前10分钟配）：在两升双蒸水中加入2gAgNO3，3ml37％甲醛。（4）漂洗：双蒸水冲洗胶板不超过5秒钟。（5）显影：在2升冷却的显影液中轻轻的摇动，直至带纹的出现。附显影液配方：在2升双蒸水中加入60gNaCO3，完全溶解后放入4℃冰箱冷却至4℃（6）定影：加入等体积的固定/停止液（即脱色中所用的），固定2分钟。（7）冲洗：用双蒸水冲洗2次，每次2分钟。（8）胶的干燥：室温下自然干燥。附表：接头和引物序列编码接头和引物序列Ead55-CTCGTAGACTGCGTACCEad35-AATTGGTACGCAGTCTACMad55-GACGATGAGTCCTGAGMad35-TACTCAGGACTCATEA005-GTAGACTGCGTACCAATTCA-3MC005-GACGATGAGTCCTGAGTAAC-3EA015-GACTGCGTACCAATTCATC-3EA025-GACTGCGTACCAATTCAGA-3EA035-GACTGCGTACCAATTCACG-3EA045-GACTGCGTACCAATTCATG-3EA055-GACTGCGTACCAATTCAAG-3EA065-GACTGCGTACCAATTCAAC-3E015-GACTGCGTACCAATTCAGC-3E025-GACTGCGTACCAATTCACC-3E035-GACTGCGTACCAATTCACA-3E045-GACTGCGTACCAATTCACT-3E055-GACTGCGTACCAATTCAGG-3E065-GACTGCGTACCAATTCAGT-3E075-GACTGCGTACCAATTCAG-3MC015-GATGAGTCCTGAGTAACAG-3MC025-GATGAGTCCTGAGTAACCA-3MC035-GATGAGTCCTGAGTAACTG-3MC045-GATGA