食品安全与微生物污染

食品安全与微生物污染

随着人们生活水平的提高，食品安全问题逐渐成为国家政府和公众关注的焦点。在众多食品安全相关项目中,微生物及其产生的各类毒素引发的污染备受重视。微生物污染造成的食源性疾病仍是世界食品安全中最突出的问题。加工食品所含菌的种类、数量,常随原料的生产环境及细菌学质量、工厂环境与包装工程的卫生及处理状况、制品贮运状况等而异。食品达到细菌学的卫生条件是最终制品中不允许存在致病菌,即使存在食物中毒菌,也必须达到不损害人体健康的安全水平。由于食品微生物污染的广泛发生,严重影响人民的健康,因此食品微生物检验工作对评价食品卫生质量,保证消费者饮食卫生有着极为重要的作用,并且研究灵敏度更高、特异性更强、简便快捷的食品安全检测技术和方法,建立和完善食品安全微生物检测技术和体系迫在眉睫。在各种食品生产加工单位均设有化验室,开展食品微生物检验工作。在食品质量监测部门,为了监督监测食品生产销售单位的食品卫生质量,也都设有专门的微生物检验室,对食品微生物污染进行检测和调查研究。为了更好地开展食品微生物检验和调查研究工作,提高食品的卫生质量,保证消费者饮食安全,文章对微生物的检验内容以及检验新技术的研究动向进行详细的介绍。1食品微生物试验的内容和特点轻工食品行业的生产厂家都要进行产品质量控制,细菌总数、大肠菌群、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等是细菌检验的重要指标。1.1食品微生物试验包括食物微生物试验的内容食品微生物检验的内容主要有以下几类:1.1.1细菌菌落个数(1)细菌总数细菌总数又称菌落总数,主要作为判断食品及生活饮用水被污染程度的指标。细菌总数是指食品及生活饮用水检样经过处理,在一定条件下经过培养后,所得1g或1mc检样中所含细菌菌落个数。这一数据可以为被检样进行卫生学评价时提供依据。(2)大肠菌群大肠菌群系指一群在37℃培养24h后能发酵乳糖、产配、产气、需氧或兼性厌氧的革兰氏染色阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标菌评价生活饮用水及食品的卫生质量。大肠菌群数在食品及水中有不同的含义。食品中的大肠菌群数是以每100mL(g)样本中,大肠菌群数的最近似数(M、P、N)表示。水中的大肠菌群数是指1000mL被检样品中所发现的大肠菌群数。1.1.2志贺氏菌的测定在GB4798-94食品卫生检验方法中,对某些微生物的数量已明确规定,除要检测食品污染程度指示菌,如菌落总数、大肠菌群(MPN)的测定外,还有致病菌如金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌、蜡样芽胞杆菌都需菌数计算。有人研究,志贺氏菌属传染剂量在200-10000个范围内;副溶血性弧菌神奈川阳性株使人发生食物中毒的活菌数,少数情况下约10万,超过1000万时,则半数以上发病;产气荚膜杆菌在引起人们食物中毒的食物中含量超过106/g则引起食物中毒。Hange.s对蜡样芽胞杆菌的研究称,一般食品中含菌量为108～109/g便能引起食物中毒,少于此量,不发病。从上述举例说明,诊断食物中毒反作定性的试验是不够的,还需对致病菌定量检验。笔者认为,随着科技发展,各种致病菌的定量检验必将全面开展。食品微生物检验工作者必须不断摸索,积累致病菌的定量检验,使其他致病菌的定量检验早日开展。1.2微生物指标检验食品微生物检验特点主要有以下五点。(1)食品微生物检验涉及的微生物范围广,种属多;采集食品微生物检验样品比较复杂,要求高。食品微生物检验的范围包括:(a)经食物传播的病原微生物,是人类疾病病原微生物、畜禽疫病的病原微生物、人兽共患传染病病原微生物。这几类微生物可达数百种。(b)引起人类食物中毒的微生物及其毒素,如沙门氏菌、副溶血性弧菌、小肠结肠炎耶尔森菌、黄曲霉菌等数十种之多。(c)引起食品腐败变质的微生物。(d)食品工业微生物,如酿造发酵工业用霉菌酵母等曲种、保健食品中双岐杆菌、乳酸菌等。在食品微生物检验中,采集样品极为重要。所采样品必须有代表性。在采样时应对食品的原料来源、加工方法、运输、保藏条件及销售中的各个环节等进行调查的基础上采集有代表性的样品,采样在无菌操作下进行,按照不同的检验目的,采样数量及方法也有所不同,同时记录采样现场的温度、湿度及卫生状况。(2)食品微生物检验需要准确、快速。食品生产后,为了保持新鲜程度,一般都是尽快地进人市场,转到消费者手中,这就要求检验工作尽快获得结果,保证食品的食用安全。另一方面,工厂化大规模生产的食品,每一批次数量较大,采样数量,采样方法和检验方法都直接影响到检验正确性,如果检验的结果不准确,将会造成严重的政治影响和经济损失。(3)食品中待分离细菌数量少、杂菌量多,对检验工作干扰严重。食品微生物检验的目的菌,主要来源于生产加工、贮存运输、销售等过程中污染的,在污染的微生物中,致病性微生物一般数量相对较少,却有大量的非致病性微生物污染,两者之间比例悬殊。另外有些致病菌在热加工、冷加工中受了损伤,使目的菌不易检出。上述这些因素给检验工作带来许多麻烦,影响检验结果。(4)食品中微生物检验具有数量观念。诊断食物中毒仅作定性试验是不够的,还需对致病菌定量检验。(5)食品微生物检验具有一定法律性质。2微生物指标的检测食品卫生微生物鉴定的传统方法有:形态结构、细胞培养、生化试验、血清学分型、噬菌体分型、毒性试验及血清试管凝聚试验等。近年来,随着分子生物学和微电子技术的飞速发展,快速、准确、特异检验微生物的新技术、新方法不断涌现,微生物检验技术由培养水平向分子水平迈进,并向仪器化、自动化、标准化方向发展,提高了食品微生物检验工作的高效性、准确性和可靠性。食品微生物检验新方法有以下几种。2.1微生物的检测(1)电阻抗法电阻抗法是近年发展起来的一项生物学技术,已经开始应用于食品微生物的检验。其原理是细菌在培养基内生长繁殖的过程中,将会使培养基中的大分子电惰性物质如碳水化合物、蛋白质和脂类等,代谢为具有电活性的小分子物质,如乳酸盐、醋酸盐等,这些离子态物质能增加培养基的导电性,使培养基的阻抗发生变化,通过检测培养基的电阻抗变化情况,判定细菌在培养基中的生长繁殖特性,即可检测出相应的细菌。该法目前已经用于细菌总数、霉菌、酵母菌、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等的检测。(2)快速酶触反应及代谢产物的检测快速酶触反应是根据细菌在生长繁殖过程中可合成和释放某些特异性的酶,根据酶的特性,选用相应的底物和指示剂,反应的测定结果有助于细菌快速诊断。如美国3MPetfifilmTM微生物测试片可分别快速测定细菌总数、霉菌、酵母菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠菌群等。(3)微量生化法Bachman和Weaver在20世纪40年代后期首先开创了微量生化法的纪元。随着人们对细菌进行快速检测的需求增加,使高精密度(90%)和高重现性的商业试剂盒得以快速发展。至今,市售的微生物鉴定用试剂盒有多种,常见的有MICRO-ID、API等。API由20个含干燥培养基的微管组成,其中的培养基用于进行酶促反应或糖发酵试验。检验时将预处理的菌悬液加入微管中培养后观察颜色变化,并记录,输入APILABPlus软件得出结果。API创建了独特的数值鉴定法,可鉴定15个系列、600多个细菌种。因此具有简单、快速、可靠等特点。(4)放射测量技术放射测量技术是根据细菌在生长繁殖过程中代谢碳水化合物的CO2的原理,把微量的放射性14C标记引入碳水化合物或盐类等底物分子中进行检测。在细菌生长时,这些底物被利用并释放出含放射性的14CO2,然后通过自动化放射测定仪Bactec测量14CO2的含量,来判断细菌的数量。这一方法已用于测定食品中的细菌,具有快速、准确度高和自动化等优点。减改华等应用放射测量技术对大肠杆菌进行定量检测。2.2t聚苯乙烯法抗体方法在食品微生物检验中应用广,根据检测技术的不同又可分为两类:(1)乳胶凝集反应利用抗原与抗体特异性结合的特性,加上人工大分子的乳胶颗粒而发生肉眼可见的凝集反应。AureusTest用于食品样品中金黄色葡萄球菌的检测,该试剂盒中含有对免疫抗蛋白AIgG和鞭毛蛋白敏感的聚苯乙烯乳胶粒子,因细菌蛋白A和IgG结合,凝聚酶和鞭毛抗原结合,所以当含有金黄色葡萄球菌的样品悬浮液加入含乳胶粒子的试剂盒中时1min内将产生凝集反应。该法的灵敏度和特异性均较高。(2)酶联免疫吸附法这是用于定性或定量测定特异抗原抗体的一种技术,它多采用“夹心式”设计,即用抗体包被聚苯乙烯孔捕获抗原,用另一个结合了酶的抗体与抗原结合形成抗原抗体复合物,再用一种生色酶底物通过肉眼观察或比色法记录结果。随着单克隆抗体酶联免疫技术的出现,免疫检测法的特异性有了明显的提高。2.3核酸探针检测技术(1)核酸探针技术将已知核苷酸序列DNA片段用同位素或其他方法标记,加入已变性的被检DNA样品中,在一定条件下即可与该样品中有同源序列的DNA区段形成杂交双链,从而达到鉴定样品中DNA的目的,能认识到特异性核苷酸序列有标记的单链DNA分子核酸探针或基因探针。根据核酸探针中核苷酸成分的不同,可将其分成DNA探针或RNA探针;根据选用基因的不同分成两种,一种探针能同微生物中全部DNA分子中的一部分发生反应,它对某些菌属、菌种、菌株有特异性,另一种探针只能限制性同微生物中某一基因组DNA发生杂交反应,它对某种微生物中的一种菌株或仅对微生物中某一菌属有特异性。核酸探针检测技术的最大优点是:①特异性;②敏感性。但探针检测技术中也存在一定的问题,如检测一种菌就需要制备一种探针;要达到检测量还要对样品进行一定时间的培养;探针检测是分析基因序列,对毒素污染的食品有时因样品中不含产毒菌而无法检测。(2)聚合酶链式反应(PCR)技术基因探针技术虽已广泛应用,但主要问题是灵敏度不够高,使基因探针技术应用受到限制。1983年,美国Getus公司和加利福尼亚大学的Hulis和Erlich创建了一种能在体外进行DNA扩增的简易、快速、灵敏和高特异性的聚合酶链式反应(PCR),在一定程度上解决了基因探针所存在的问题。其原理为通过加热使双链DNA经裂解成两条单链,成为引物和DNA聚合酶的模板;然后降低温度,使寡聚核苷酸引物与DNA分子上的互补序列退火。通常退火温度越高,扩增特异性越好。然后升高温度,使DNA合成得以进行,合成的DNA片断越大,所需时间越长。如此重复上述加热变性双链、引物退火和链延伸循环过程,每次循环将靶DNA扩增一倍。经3～4h后,就能使靶DNA扩增106。测定PCR产物的方法较多,如凝胶电泳法、比色测定法及化学发光测定法等。目前,已有自动化PCR检测试剂盒对仪器,使用方便,虽需增菌且需专用设备。但PCR技术是一项全新的技术,快速、灵敏、准确,在细菌诊断方面具有广阔的前景。2.4其他快速检测方法随着微生物快速检测法的不断发展,很多检验技术日趋成熟和完善,并被人们进一步开发、研制成自动或半自动微生物检测仪。(1)流式细胞术(FCM)该技术是用流式细胞仪对细胞悬液进行自动快速定量分析和分选的新技术,具有速度快、精确度高、记数细胞量大以及参数分析、全面测量细胞和分选细胞等优点。由于FCM检测到的荧光强度的强弱与DNA片段的大小成比例,根据荧光浓度的直方图就可知道细菌的DNA指纹图谱,从而确定细菌的种类。现在该技术已经能够检测纯化的DNA可达pg级水平,在10min内可以完成数据的收集和分析。近年来在临床实验室已经逐步用于病毒、细菌的检测、计数、鉴定等。(2)免疫磁性微球免疫磁性分离技术不但广泛用于医学的各个领域,而且在食品卫生检测方面的应用也见端倪。由于食品检样常为固液多相混合体,采用常规方法难以将少量的致病微生物分离出来。借助免疫磁性分离技术,可以达到快速分离的目的。免疫磁性分离技术与常规检验方法相比具有显著的优点,可以很快地在含有大量杂菌的悬液中有选择性地分离出目的微生物,并节省时间。(3)电阻电导检测器原理是当细菌生产繁殖时,将蛋白质、糖类等大分子物质分解成氨基酸、有机酸等带电荷的小分子物质,改变培养液的导电度,这样,测量电阻和导电度的变化,就可推算出样品原来的含菌数。(4)VITEK-AMS该系统为用于微生物鉴定及药敏试验的设备,其原理是将微生物数码鉴定的方法与计算机技术结合起来,实现了从读数、编码、解码、打印结果的鉴定全过程的自动化。其特点为:①鉴定细菌类型广;②具有最大的准确性;③鉴定时间短;④高度可重复性;⑤仪器操作方便。(5)VIDAS全自动免疫分析仪VIDAS全自动化荧光酶标免疫测试系统的特点和优点为:全自动操作,所有样品的洗涤、结合、基质读数及报告说明等都是全自动操作;快速测定:由样品进入仪器计算,约需1～2.5h即可出结果及报告,容量大