胶原纤维吸附剂分离纯化黄酮类化合物

胶原纤维吸附剂分离纯化黄酮类化合物

1柱层析填料吸附法芹菜素是一种天然的黄酮类化合物，广泛存在于各种水果、蔬菜和茶叶中。芹菜素具有抗氧化、降血压和预防肿瘤等作用。但是,在植物提取物中,芹菜素与槲皮素、杨梅素等黄酮类化合物共存,而且由于它们的结构非常相近(如图1所示),从它们的混合物中分离得到高纯度的芹菜素具有相当大的难度。目前,多采用柱层析法对芹菜素进行分离纯化。常用的柱层析填料有聚酰胺、硅胶、大孔树脂等。近年来,一些具有较好生物相容性的吸附剂已得到广泛的关注,如纤维素、壳聚糖、琼脂糖和丝素蛋白等。研究表明,胶原可通过氢键与多种多酚类化合物结合,而且这种氢键结合能力与多酚的分子结构密切相关。例如单宁与胶原具有较强的氢键结合能力,因此本课题组以胶原制备的吸附材料能选择性地除去天然产物中的单宁(鞣质);另外,由于黄酮和生物碱的分子结构差异较大,与胶原的氢键结合能力不同,所以这种吸附材料还能有效地分离黄酮和生物碱的混合物。如图1所示,芹菜素、槲皮素和杨梅素在分子结构上主要表现在B环上的酚羟基数目不同,与胶原纤维的氢键结合能力也应该有差异,因此胶原纤维吸附材料有可能将它们的混合物分离开。胶原纤维主要来自家畜动物的皮,是世界上资源量最大的可再生生物质之一,具有良好的生物相容性和可生物降解性。所以,本文以戊二醛交联胶原纤维制备具有一定热稳定性的吸附剂,通过柱层析研究其对芹菜素、槲皮素和杨梅素模拟的黄酮类混合物中芹菜素的分离纯化特性。选择乙醇和水作为层析淋洗液,以消除对目标产物可能产生的污染。2材料和方法2.1仪器、试药与仪器Agilent1100HPLC高效液相色谱(安捷伦科技有限公司);Aichrombond-AQC18液相色谱柱(粒径5μm,直径4.6mm,长度150mm);∅1.6cm玻璃色谱柱(上海锦华层析设备厂);JSM-5900LV扫描电子显微镜(日本电子株式会社);TriStar3000比表面与孔隙度分析仪(美国麦克仪器公司)。芹菜素、槲皮素和杨梅素(陕西慧科植物有限公司,纯度均为98%);色谱级甲醇;分析纯无水乙醇。2.2胶原纤维的制备以牛皮为原料,经浸水、碱处理、脱碱、干燥、研磨等过程制备胶原纤维。取胶原纤维15g,用300mL蒸馏水浸泡12h。加入10mL50%的戊二醛,于30℃下反应5h。过滤后用蒸馏水洗涤和无水乙醇洗涤,过滤,最后于45℃下干燥12h得到胶原纤维吸附剂。2.3胶原纤维吸附剂溶液的hplc分析配制芹菜素、槲皮素和杨梅素混合溶液,3种组分的浓度均为30mg/L,溶剂为10%~100%的乙醇水溶液(体积分数)。吸取各混合溶液15mL,分别加入装有0.15g胶原纤维吸附剂的碘量瓶中,水浴振荡12h后过滤(25℃,转速120r/min),对滤液进行HPLC分析,按式(1)计算各组分的吸附率:Eh=B0−B1B0×100%(1)Eh=B0-B1B0×100%(1)式中,Eh为吸附率,B0为吸附前HPLC峰面积,B1为吸附后HPLC峰面积。2.4回收率的测定取18g胶原纤维吸附剂装柱,柱高为48cm,床层体积为96mL。用纯乙醇配制芹菜素、槲皮素和杨梅素混合溶液,3种组分浓度均为5mg/mL,吸取1mL上柱,用100%~70%乙醇水溶液分步淋洗。每30min收集10mL洗脱液,以HPLC分析洗脱液中各组分的浓度,并按式(2)和(3)计算纯度及回收率:P=M1M1+M2×100%(2)R=M1M0×100%(3)Ρ=Μ1Μ1+Μ2×100%(2)R=Μ1Μ0×100%(3)式中,P为纯度,R为回收率,M0为分离前目标组分的质量,M1为分离后目标组分的质量,M2为分离后非目标组分的质量。将淋洗条件变为用40%~60%乙醇水溶液进行分步淋洗,其余操作同上。2.5柱高的确定分别用10和18g胶原纤维吸附剂装柱,柱高分别为24.4和48cm。将2.4中配制的3组分混合溶液上样1mL,采用40%~60%乙醇水溶液分步淋洗。2.6原纤维吸附剂的重复使用与2.4相同,用40%~60%乙醇水溶液进行分步淋洗,如此重复5次。3结果与讨论3.1热变性能测定牛皮经过研磨后制备的胶原纤维的粒度为0.1~0.25mm,热变性温度为60~65℃。戊二醛交联胶原纤维制备成吸附剂后的热变性温度为80~86℃,热稳定性得到提高。比表面积测定表明,胶原纤维吸附剂的比表面积为1.97m2/g,与一些典型的聚合物吸附材料的比表面积相当。扫描电子显微镜显示,戊二醛交联后的胶原纤维吸附剂仍具有明显的纤维结构,如图2所示。与多孔硅胶等常规多孔材料相比,具有纤维结构的吸附剂有更高的传质速率和较低的床层阻力,因而更利于大规模的工业应用。3.2乙醇对紫菜素等氢键作用的影响混合物中各组分在不同乙醇水溶液中的静态吸附结果如图3所示。可见,胶原纤维吸附剂对芹菜素等3种黄酮化合物的吸附呈现一定的选择性,对芹菜素的吸附率最低,因为胶原纤维对黄酮化合物的吸附主要是基于氢键作用。由图1可见,芹菜素分子中—OH等可形成氢键的活性基团最少,所以与胶原纤维的氢键作用最弱,吸附率最低;另一方面,乙醇浓度影响芹菜素等在胶原纤维上的吸附率,因为乙醇浓度对氢键的形成影响较大。随着乙醇溶液浓度的增大,芹菜素、槲皮素和杨梅素的吸附率均先减小后增大。当乙醇浓度>90%和低于50%时,3种化合物呈现较大的吸附差异,而在60%和70%乙醇水溶液中,三者的吸附率均较低。因此,在柱层析中,可以通过调节乙醇水溶液的浓度来分离纯化芹菜素等3种黄酮化合物。根据静态吸附的结果,可以采用100%~70%乙醇水溶液和40%~60%乙醇水溶液进行分步淋洗。3.3菜素和槲皮素的分离纯化根据静态吸附实验中得到的淋洗条件,对混合物进行柱层析分离,结果如图4所示。图4(a)为采用100%~70%乙醇水溶液进行分步淋洗的分离谱图,可见芹菜素首先被洗脱出来并得到分离纯化,其纯度为98.03%,回收率为100%;另外,少量槲皮素也随后被洗出。图4(b)为采用40%~60%乙醇水溶液分步淋洗的分离谱图,可见芹菜素和槲皮素均得到了有效的分离纯化,二者的纯度分别为99.16%和99.47%,回收率分别为100%和91.22%。在以上两次淋洗过程中芹菜素总是被首先洗出,与静态吸附的结果一致,这是因为芹菜素分子中—OH等活性基团较少,与胶原纤维的氢键结合力较弱,因而更容易被洗脱。3.4层析柱的高度对混合体系,分别使用高度为24.4和48cm的胶原纤维层析柱进行分离纯化,分离结果如图5所示。当均使用40%~60%乙醇水溶液分步淋洗时,高度为24.4cm的层析柱分离得到的芹菜素和槲皮素分离程度相对低一些,且有少量的杨梅素被洗出,而高度为48cm的层析柱可以分离得到高纯度的芹菜素和槲皮素。可见,胶原纤维层析柱的高度对分离纯化起着重要的作用。由于芹菜素等3种黄酮化合物与胶原纤维有不同的氢键结合能力,因而在胶原纤维层析柱上的移动速率不同。随着层析柱柱高的增大,3种黄酮化合物在柱上移动距离的差异也增大。当层析柱的柱长增大到一定程度,使得三者的移动距离产生足够大的差别时,三者即得到完全分离。所以,适当增大胶原纤维层析柱的柱长,有助于芹菜素的有效分离和纯化。3.5重复使用性的特点考察了胶原纤维吸附剂的重复使用性,结果见表1。在5次重复分离实验中,芹菜素都能得到有效的分离,其纯度均在97%以上,回收率均在98%以上,而且在每次重复使用前,简单用乙醇水溶液淋洗一定时间即可,不需要特殊的再生操作,表现出比大孔树脂和葡聚糖凝胶更好的可重复使用性。4山梨酸、苏叶酸、三环不同的黄酮类化合物与胶原分子具有