紫杉醇纳米脂质体的制备及在小鼠组织分布中的分布

紫杉醇纳米脂质体的制备及在小鼠组织分布中的分布

紫杉醇（ptx）是通过超过12000个天然化合物的抗高血压药物筛选而获得的最佳结果。因为它独特的微管稳定效果，因此被广泛用于治疗乳腺癌、卵巢、前列腺、头颈部肿瘤、非小细胞肿瘤和风病性关节炎。PTX水中溶解度极低(约为0.001g·L-1)。普通制剂处方由聚氧乙烯蓖麻油(CremphorEL)∶无水乙醇(1∶1,V/V)组成。CremophorEL会引起组胺释放,使用前需要给予抗过敏类预防药物,即使如此仍有超过2%的严重过敏反应发生可引起死亡。对PTX新剂型的研究一直以来都非常活跃。已经报道的剂型主要包括脂质体、血红蛋白结合物、纳米粒、胶束、微球、包合物、微乳等。国外从20世纪90年代初就已经开始PTX脂质体研究,结果表明制成脂质体后明显降低了毒性,且保持了与市售PTX注射液相同的抗肿瘤活性。国内也有相关研究报道,并在2003年上市了PTX脂质体(商品名:力朴素)。但国内脂质体制剂的开发仍局限在使用磷脂/胆固醇的脂质体处方,冻干品复溶后粒径增大,药物易泄漏析出。普通PTX脂质体静脉给药后容易在肝脾蓄积。我们制备了包封率高稳定性好的纳米脂质体,并对PTX脂质体及市售注射剂Anzatax在小鼠体内组织分布进行了比较。1实验细胞、试剂和仪器1.1试剂PTX脂质体:自制;PTX注射液:Anzatax(F.H.Faulding公司);甲醇(江苏汉邦科技有限责任公司,色谱纯);乙腈(Burdick&Jackson,USA,色谱纯);肝素钠(上海第一生化药业有限公司,生化试剂);无水乙醚(中国医药上海化学试剂公司,分析纯);地西泮对照品(上海药品检验所,纯度>99.5%);重蒸水:自制。1.2仪器NicompTM380ZLS型Zeta电位及粒度测定仪(美国SantaBarbara公司);岛津高效液相色谱仪(Shimadzu公司),包括SPD-6AV紫外检测器与LC-10ATVP泵;GeminiODS色谱柱(4.6mm×150mm,5μm)及保护柱(Phenomenex公司);JY92-1I探头超声波细胞粉碎仪(宁波新芝生物科技股份有限公司);AmiconUltra-4超滤管(截留相对分子质量30000,美国Millipore公司)。1.3PTX纳米脂质体的制备称取处方量的注射用大豆卵磷脂(磷脂酰胆碱含量80%,含磷脂酰甘油、磷脂酰酰丝氨酸等负电荷脂质)、PTX置250mL茄形瓶中,氯仿-甲醇(1/1,V/V)混合溶剂溶解完全。旋转蒸发器上小心抽干有机溶剂成均匀薄膜,薄膜置真空干燥器内干燥过夜。一定浓度的冻干保护剂溶液水化干燥薄膜得白色乳状脂质混悬液。探头超声该乳状液10min得淡蓝略带蓝色乳光的脂质体胶体溶液,0.22μm微孔滤膜过滤整粒并除去超声探头上掉下的钛粒,分装到西林瓶内,冷冻干燥成品。1.4组织样品的测定1.4.1色谱条件参照文献并进行改进。流动相:乙腈∶0.35mol·L-1乙酸铵缓冲液(乙酸调pH5.0)=50∶45,检测波长230nm,流速1.0mL·min-1,进样量20μL。1.4.2组织样品处理取各组织,剪碎,加入水和乙腈混合液(水∶乙腈=1∶1)1mL,冰浴,以超声波细胞粉碎机匀浆,10000r·min-1离心10min,取上清液0.5mL。加入内标地西泮(1mg·L-1)50μL,旋涡混合30s后,用3mL无水乙醚提取,振摇2min,4000r·min-1离心10min,取上层有机溶剂于40℃浴上氮气流吹干,用100μL乙腈溶解,取20μL进样HPLC分析。1.5给药设计昆明小鼠72只[♀,体重(20±5)g,本校实验动物科学部提供],随机分为2组,每组36只。分别尾静脉注射PTX脂质体和Anzatax(5%葡萄糖溶液稀释至0.5g·L-1),注射剂量按PTX计3mg·kg-1。给药后0.083、0.25、0.5、1、2、3、4、6、8h处死,取心、脑、肝、肾、脾、肺组织,精密称取重量后,血浆及脏器经预处理后,进行HPLC法测定。1.6数据处理2种制剂在同一时间点同一组织浓度的比较采用SPSS统计分析软件进行方差分析。梯形法计算PTX在各组织的AUC0→8h,以比较蓄积情况。2结果2.1脂质体包封率测定2.1.1形态与粒径显微镜结合透射电镜检查无PTX结晶析出。透射电子显微镜下观察可见圆形或类圆形粒子。Nicomp粒度仪测定结果如图1。体积权重粒径为(54.1±26.0)nm,90%粒子的粒径<100nm。2.1.2包封率采用超滤法测定PTX脂质体包封率。取超滤管,上样脂质体0.5mL,4000r·min-1离心10min,收集下清液,HPLC分析下清液中PTX含量(ρ游离)。测定脂质体胶体溶液中PTX总浓度(ρ总),根据以下公式计算包封率:包封率=(ρ总-ρ游离)/ρ总×100%。测得包封率均>80%,符合《中国药典》规定。2.1.3与葡萄糖注射液配伍稳定性冻干品复溶后,用5%葡萄糖注射液稀释3倍,室温密封放置24h,测定粒径(PS)、包封率(Entp),均未发生明显变化(表1)。2.2ptx在小鼠各组织中pac-a及anrapts检测2.2.1标准曲线范围和各组织浓度PTX在血浆、心脏、肝脏、脾脏、肺、肾组织的标准曲线范围分别为:0.02～3.60、0.10～2.00、0.10～8.00、0.25～8.00、0.10～2.00、0.10～3.00mg·L-1。超出标准曲范围上限的点使用空白血浆或组织匀浆适当稀释后测定。PTX对照组Pac-A在小鼠各组织中的浓度测定结果见表2。脑组织中检测浓度均低于检测限。PTX脂质体在小鼠各组织中的浓度测定结果数据见表3。脑组织中检测浓度均低于检测限。2.2.2组织蓄积PTX脂质体和Anzatax静脉给药后,分别使用梯形法计算0～8h内小鼠各组织经时曲线下面积AUC,结果见表4。相对Anzatax,PTX包封进入脂质体以后,仅在肝脏造成轻微蓄积,0～8h的AUC肝脏仅仅从67.2μg·h·g-1提高到89.7μg·h·g-1,在脾脏也未见蓄积。其中肝脏AUC0→8h仅仅提高34%,脾脏AUC0→8h提高6%。3新型脂质体制剂的安全性分析普通PTX脂质体使用磷脂/胆固醇包裹PTX,PTX为强脂溶性药物,药物被包封在脂质体的脂质双分子层中。胆固醇的存在会竞争结合磷脂的亲脂性区域,导致载药量低,药物容易泄漏析出。有研究表明目前国内外上市的唯一PTX脂质体制剂——力朴素复溶后粒径很大。本课题组根据国内外研究报道,结合前期实验成果,使用普通注射用大豆磷脂、蔗糖为冻干保护剂,制备PTX纳米脂质体,不含胆固醇,包封率高,稳定性好,冻干品重建并使用5%葡萄糖注射液稀释后脂质体的粒径和包封率均没有发生明显改变。普通脂质体静脉给药后容易被肝脾等网状内皮系统发达的脏器摄取蓄积,可能在减少原有制剂不良反应的情况下引起其他异常毒性。所以,需要从药动学、组织分布、急性毒性等角度来对新型脂质体制剂研究进行验证,确保其安全可靠。普通PTX脂质体注射液静脉给药以后,在肝脾部大量蓄积,相对Taxol注射液,普通PTX脂质体在肝脏蓄积提高6.30倍,脾脏蓄积提高19.6倍。普通PTX脂质体注射液静脉给药以后肝脾蓄积的主要原因在于其脂质体粒径很大,容易在肝脾等网状内皮系统发达的脏器被摄取截留,而且由于处方中的胆固醇成分脂质体能够较稳定的存在,所以引起肝脾蓄积。肝脾药物大量蓄积可能导致异常毒性的出现。而我们开发的纳米脂质体,药物在肝脏的蓄积仅仅提高34%,而在脾脏蓄积仅提高6%。其原因在于处方中不含胆固醇,脂质体进入体内以后,脂质成分能够迅速和血液中的蛋白发生交换,药物离开脂质体和蛋白结合。同时对给药后各时间点小鼠心、肝、脾、肺、肾中PTX的浓度进行方差分析表明,静注5min后,药物浓度在肝、肺、肾脏比Anzatax有显著性提高;而静注15min后,PT