基于荧光标记和共聚焦激光扫描显微镜技术的生物膜硝化菌群分布研究

基于荧光标记和共聚焦激光扫描显微镜技术的生物膜硝化菌群分布研究

好氧生物膜检测器在废水去除过程中得到了广泛应用。生物膜内硝化菌群的空间分布规律、群落结构和功能变化直接影响到反应装置中氨氮的去除效果。因此，我们了解了不同环境下生物膜中硝化菌群的空间分布和群落结构的变化规律，探讨了生物膜探测器中微生物分解污染物的机理，并进一步提高了生物膜检测器的污染物处理效率。荧光原位杂交技术(fluorescentinsituhybridization,FISH)是近年来生物学领域发展起来的一项新技术.其基本原理是,微生物细胞在脱水后,与带有荧光染料标记的寡核苷酸探针(oligonucleotideprobes)在一定温度下混合,具有与探针碱基对完全互补序列的RNA随即与探针发生杂交,从而使该菌体在荧光显微镜下发出荧光.利用带有荧光标记的特异性寡核苷酸探针,与细胞内相应的靶核糖体结合,能将微生物探测、鉴定到属或种的水平.该技术目前已广泛用于遗传疾病、肿瘤研究、临床诊断以及环境检测等领域.目前,FISH技术已经成为分析生物膜中硝化菌群的分布特征的重要手段之一.通过FISH与激光共聚焦扫描显微镜(confocallaserscanningmicroscopy,CLSM)联用,可以考察生物膜系统中不同微生物群体之间的空间关系.Beer等人首先采用微量注射技术将荧光染料注射到生物膜表面,然后,采用CLSM跟踪定量染料的传质扩散过程,最后计算出扩散系数.Stewart等人通过CLSM观察和检测实验室中培养的2种微生物共存形成的生物膜,结果认为生物膜中微观的非均匀性以及2菌种附着和脱落能力的不同,是造成两者共存形成生物膜的主要原因.Jayaraman等人利用CLSM对抑制好氧生物膜腐蚀钢铁的方法进行了机理探讨,他们认为是生物膜的代谢和更新,为其中的微生物,如:Pseudomonasfragi或者E.coli,提供了保护作用,使其能够长期停留在钢铁表面上,进而造成对钢铁的腐蚀.本文即利用FISH与CLSM联用技术,来初步探讨一种新型悬浮载体生物膜反应器中,生物膜内硝化菌群空间分布的变化规律,进而为提高反应器的脱氮效果提供理论依据.1材料和方法1.1生物膜反应器运行参数试验所用反应器为结构改进后的新型悬浮载体生物膜反应器(SCBR),其结构示意图如图1所示.反应器采用有机玻璃加工而成,反应区有效体积为6L,沉淀区有效体积为2L.生物膜载体选用聚氯乙烯柱状粒料,直径为2.5mm,高度在2.5～3.0mm之间,颗粒比重为1.0042,比表面积为30.7m2/kg,如图2所示.反应器底部采用微孔金属板曝气,一方面对反应器内微生物供氧,另一方面保证反应器内载体的充分悬浮.试验采用3组结构完全相同的悬浮载体生物膜反应器,3个反应器的水力停留时间均为1.0h,进水COD/NH+4-N分别为15、10和5,从反应器中取出载体颗粒表面的生物膜进行分析.各SCBR反应器的主要运行参数和条件列于表1.1.2荧光探针的制备采用荧光原位杂交技术(FISH)分析生物膜内硝化菌群的空间分布.首先从3个反应器中分别取出生长有生物膜的悬浮载体颗粒3粒,加入1mL的塑料离心管中,用99.5%乙醇对样品进行脱水固定,然后加入杂交液和荧光探针溶液,放入杂交炉中进行1～3h杂交染色,用清洗液清洗后,利用共聚焦激光扫描显微镜进行观察拍照,利用AxioVision软件对所得图像进行三维重建,从而分析荧光信号的三维分布情况,得到生物膜厚度、表面积及分布体积等信息.硝化菌群中的氨氧化菌和亚硝酸盐氧化菌可采用不同荧光颜色的探针进行杂交,进而根据荧光颜色的不同来区分细菌的种类.本试验所用荧光探针及其主要特性,如表2所示.1.3分析项目和方法COD采用标准方法测定.氨氮采用纳氏试剂法测定.生物膜微观结构采用共聚焦激光扫描显微镜(ZeissLSM510META)观察.2结果与讨论2.1荧光探针eid3荧光分布荧光探针EUB338是1种用于标记绝大多数真细菌种类的广谱性探针.在本试验中其所用的荧光标记染料为Cy3,通过波长为514nm的激光照射.所得CLSM照片中Cy3荧光信号的分布反映了荧光探针EUB338在生物膜内杂交后的三维分布,进而表征了生物膜中大部分真细菌的主要空间分布情况,如图3所示.由图3可以看出,细菌在生物膜内的三维空间分布是不均匀的,而且许多细菌团聚在一起,形成菌团.同时发现生物膜内存在空隙或者沟槽,其中没有细菌分布,这些结构可能与生物膜内基质和微生物代谢产物的传质有关.本试验研究结果表明,SCBR内载体表面生物膜的总体厚度在80～120μm左右.2.2生物体系化菌群的空间分布标记氨氧化菌所用的探针为NSO190,该探针主要用来标记β-亚群氨氧化菌.在本试验中其所用的荧光标记染料为FAM.氨氧化菌在悬浮载体生物膜内的空间分布情况如图4所示.由图4可以看出,氨氧化菌主要分布在生物膜表面的25～35μm左右范围内.亚硝酸盐氧化菌的标记探针为NIT3,其在生物膜内的空间分布情况如图5所示.由图5可以看出,亚硝酸盐氧化菌主要分布在生物膜表层的10～20μm左右范围内.Okabe等人曾用用FISH方法对生物转盘上的生物膜进行研究,发现氨氧化菌和亚硝酸盐氧化菌分布在生物膜表层的100μm左右.Gieseke等人利用FISH方法对生物移动床内载体表面生物膜的结构进行了分析,其研究结果表明,其生物膜的平均厚度在500μm左右,亚硝酸盐氧化菌主要分布在表层200～250μm的范围内.而本研究所得硝化菌群在生物膜中的分布情况,如图6所示.由图6可见,SCBR内载体表面的生物膜要比一般的污水处理反应器内的生物膜薄,而且氨氧化菌和亚硝酸盐氧化菌分布的厚度范围也较小.其原因可能是由于SCBR内较高的载体浓度和特殊的水力条件,而使生物膜形成薄而密实的结构.2.3悬浮载体生物膜反应器内生物膜菌群的变化对不同进水COD/NH+4-N的情况下,SCBR中载体表面所形成的生物膜内硝化菌群的空间分布进行了比较,结果如图7所示.由图7可以看出,随着进水中COD/NH+4-N的增加,氨氧化菌和亚硝酸盐氧化菌在整个生物膜中所占的比例逐步下降,而异养细菌所占比例逐步增加.当进水COD/NH+4-N从5增加到15时,氨氧化菌在生物膜菌群中所占比例由52.3%下降到20.1%,亚硝酸盐氧化菌所占比例则从30.6%下降到8.5%,而异养菌在生物膜菌群中的所占比例则从17.1%上升到71.4%.对于试验所采用的SCBR,当进水COD/NH+4-N在5～15之间时,随着进水COD/NH+4-N的增加,SCBR对氨氮的去除率呈线性下降趋势,如图8所示.当进水氨氮平均浓度控制在13mg/L时,进水COD/NH+4-N从5增加到15时,SCBR对氨氮的平均去除率从55.9%下降10.0%.综合图7和图8可以看出,随着进水COD/NH+4-N的增加,悬浮载体生物膜反应器内生物膜中硝化菌群所占比例逐渐下降,异养细菌所占比例逐渐增加,导致了反应器对氨氮去除效果的下降.3scbr去除氨氮的能力(1)悬浮载体生物膜反应器内生物膜的总体厚度在80～120μm左右,氨氧化菌和亚硝酸盐氧化菌主要分布在生物膜表面的20～30μm左