中药复方中药对小鼠急性毒性研究

中药复方中药对小鼠急性毒性研究

朱沙是由否定的砂矿组成的矿石，也被称为丹砂和郴州砂。入药始载于《神农本草经》至今已有2000多年历史。其具有清心镇惊,安神解毒的功效。朱砂主要成分为HgS,另外还含有少量的游离汞和可溶性汞盐。轻粉(Hg2Cl2),又名甘汞,也是一种含汞的矿物药。由于朱砂和轻粉都含汞等重金属离子,自古以来就被认为是一种有毒之品,在国外甚至限制其使用,质疑甚至反对朱砂和轻粉入药者颇有人在,大大影响了其在临床上的应用。朱砂安神丸是临床上常用的安神中成药,但其汞含量超欧洲药典标准10万倍,究竟朱砂安神丸毒性大小及朱砂毒性能否与其他含汞化合物如氯化汞(HgCl2)等同?本文通过对HgCl2、轻粉、朱砂及朱砂安神丸的急性毒性对比研究,来探讨朱砂及其复方(朱砂安神丸)的毒性。1材料表面1.1动物清洁级昆明种小鼠,体重20~22g,雌雄各半,由重庆市第三军医大学提供,许可证号SCXK(渝)2007001。1.2pcr、氯化汞朱砂,购自贵州省万山特区矿产公司;朱砂安神丸,购自哈药集团世一堂制药厂(批号0806708);氯化汞,轻粉,均购自美国Sigma公司,Trizol、逆转录试剂盒、PCR引物,均购自宝生物工程(大连)有限公司;PowerSYBRRGreenPCRMasterMix,购自美国ABI公司;RNA纯化试剂盒,购自上海华舜生物技术有限公司。1.3实时荧光定量pcr检测F732-V型冷原子吸收测汞仪,上海华光仪器仪表厂;原子荧光光谱仪,北京科创海光仪器有限公司;实时荧光定量PCR(RT-PCR)仪,美国BIO-RAD公司;TU-1810紫外-可见分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司;Eppendorf5417R台式高速冷冻离心机,德国Eppendorf公司;多功能梯度PCR仪,德国Eppendorf公司。2方法2.1砂操作剂量lg将42只小鼠称重后随机分为7组,每组6只,雌雄各半:空白对照组,给予正常饮食;朱砂安神丸低剂量组,10g·kg-1(Hg0.9g·kg-1),ig。朱砂安神丸高剂量组,20g·kg-1(Hg1.8g·kg-1),ig。朱砂低剂量组,0.3g·kg-1(Hg0.26g·kg-1,ig。朱砂高剂量组,16g·kg-1(Hg13.3g·kg-1),ig,HgCl2组,70mg·kg-1(Hg0.05g·kg-1),ig,轻粉组,61.2mg·kg-1(Hg0.05g·kg-1),ig,各组小鼠均早晨给药1次。8h后断头处死,取血、肝脏和肾脏。2.2肝肾功能测试血液离心取血清,按照试剂盒说明书测定血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、尿素(UREA)和肌酐(CREA)。2.3病理检测取小鼠肝脏的同一部位、同侧肾脏,10%甲醛固定,石蜡包埋,切片,HE染色,光学显微镜下观察其组织病理变化。2.4pcr扩增条件及数据表达按照试剂盒说明书提取并纯化RNA,并分别在260nm和280nm处测其吸光度,计算出A260/A280值。然后应用PCR仪进行逆转录,反应条件:25℃,10min;48℃,60min;95℃,5min;4℃后适当时候取出。反应结束后,加DEPC水,1∶1稀释。PCR扩增:PCR总反应体系为15μL,其中包括:cDNA3μL,SYBRRGREENPCRMasterMix7.5μL,DEPC水4μL,混合引物0.5μL,然后应用iCycleriQreal-timePCR仪进行扩增,扩增条件:95℃,10min;95℃,15s;60℃,60s。40个循环。引物由宝生物工程有限公司设计并合成,MT-1同义链:5′-AATGTGCCCAGGGCTGTGT-3′反义链:5′-GCTGGGTTGGTCCGATACTATT-3′;MT-2同义链:5′-TGTGCCTCCGATGGATCCT-3′反义链:5′-GCAGCCCTGGGAGCACTT-3′;以18S为内标,同义链:5′-CGAACGTCTGCCCTATCAACTT-3′反义链:5′-CCGGAATCGAACCCTGATT-3′。数据处理:以Ct值为统计参数计算下列数据:平均Ct值=(Ct1+Ct2)/2;dCt=均数-中间值;基因的表达以2^(-dCt)表示;以MT-1,MT-2基因的表达/18s基因的表达对每个MT-1,MT-2mRNA进行相对定量。2.5标准曲线的绘制参照文献方法测定肝肾组织中汞的蓄积量,称取适量组织于消化罐中,加入5mL浓硝酸,170℃烘箱中消化3h,取出后用去离子水定容至25mL。测汞仪预热0.5h后,吸取溶液5mL于汞气发生瓶中,用去离子水补足至15mL,加入200g·L-1的氯化亚锡1mL,立即通气进行测定。标准曲线的绘制:方法同上,分别吸取40μg·L-1的汞标准液0,1,2,3,4,5,10mL于汞气发生瓶中,加入氯化亚锡后立即进行测定。标准曲线回归方程为Y=0.0004X+0.0026,r=0.999。2.6统计处理实验数据以表示,应用SPSS13.0软件进行单因素方差分析检验。P<0.05表明有显著差异。3结果3.1空白对照组检测结果比较小鼠一次给药后,药物对其肝功能并无影响,各组小鼠血ALT和AST检测结果与空白对照组相比无统计学意义。HgCl2组小鼠血UREA的水平明显高于空白对照组(P<0.05),表明HgCl2对小鼠肾脏功能造成了损伤(表1)。3.2砂不同剂量对小鼠汞蓄积量的影响与空白对照组相比,HgCl2组小鼠肝肾组织中汞蓄积量远远高于其他各组(P<0.05),朱砂高剂量组、轻粉组小鼠汞蓄积量也明显增高(P<0.05),而朱砂安神丸组、朱砂低剂量组之间无明显差异(表2)。3.3砂静脉内砂对mt-2基因表达的影响与空白对照组相比,HgCl2组小鼠肝肾组织中MT-1和MT-2基因表达明显高于其他各组,朱砂高剂量组MT-1和MT-2基因表达亦高于其他各组,而朱砂安神丸组、朱砂低剂量组和轻粉组MT-1和MT-2基因表达无明显差异(表3)。3.4小鼠肝肾组织病理学反应朱砂高剂量组及HgCl2组小鼠肾脏组织肾小球变性,肾小管出现炎症反应,细胞肿胀,出现空泡(图1)。朱砂高剂量组及HgCl2组小鼠肝小叶内出现炎性细胞浸润,肝细胞肿胀,变性,出现点状嗜酸性变(图2)。4对hgs和hgcl2基因表达的影响本试验中,单次给药后,朱砂安神丸组(约是临床剂量的5,10倍)小鼠肝肾组织中汞蓄积量很少,对肝肾功能和MT-1和MT-2mRNA的表达也无太大影响,病理结果检查也未发现其对肝肾组织有明显损伤。作者以往的研究结果也发现,小鼠给予20g·kg-1的朱砂安神丸20d后,药物在肝肾组织中蓄积量很少,对MT-2mRNA的表达与空白对照组相比无明显差异。这都说明,当小鼠给予大剂量的朱砂安神丸(约是临床剂量的10倍)后,在肝肾组织内不会出现明显的汞蓄积,也不会对肝肾造成明显的病理损伤。通过本试验的研究结果,可以发现,一次性大量口服给药后,低剂量的朱砂组(约是临床剂量的5倍)小鼠肝肾组织中汞蓄积量和空白对照组相比无明显差异,病理切片也未发现明显组织损伤,但是高剂量朱砂组(约是临床剂量的200倍)小鼠却出现了明显的毒性反应,表现为肝肾组织中汞蓄积量增高,MT-1和MT-2mRNA的表达增加,并且出现了病理损伤。相对于高剂量的朱砂,HgCl2对小鼠的毒性作用更大,表现为肝肾组织中汞蓄积量更高,对MT-1和MT-2基因的诱导作用更强,并且对肾脏功能产生了影响。这就说明,虽然高剂量的朱砂对小鼠产生了毒性作用,但是其毒性仍低于HgCl2,也提示了在临床上,朱砂用量在规定的剂量范围内不会产生明显的毒副作用。朱砂的主要成分为HgS,《中国药典》规定朱砂中HgS含量不得低于96%,而HgS为一种共价化合物,极难溶于水,其溶解度仅为1.4×10-24g·L-1,由于HgS的难溶性,从而必然导致其进入人体后,难以被机体吸收利用,导致生物利用率低,据报道,HgCl2的口服吸收率为7%~15%,朱砂的口服吸收率仅为0.2%,而有机汞可高达100%。HgCl2进入体内后,主要蓄积于肾小管上皮细胞,从而导致肾脏的损伤。在本试验中,朱砂和朱砂安神丸在机体中汞蓄积量很低,但给予HgCl2后却有大量的汞蓄积于肝肾,并对肝肾造成损伤,从而说明,HgS和HgCl2的性质不同,在体内的吸收代谢途径的不同,因此导致了朱砂及其复方的毒性明显低于HgCl2。金属硫蛋白(MT)是一种富含巯基的金属结合蛋白,广泛存在于肝、心、肾等器官和组织细胞的胞质中,其可以和多种有毒金属结合,从而解除重金属对人体的毒性,对保护肝、肾等重要器官具有极其重要的意义。MT的诱导是体内汞毒性的敏感标志。在本试验中,HgCl2组小鼠肝肾组织中MT-1和MT-2mRNA表达显著增高,朱砂高剂量组也有所增高,但要明显低于HgCl2组,其他组与空白对照组相比无差异。由于HgS在体内汞蓄积量少,从而导致朱砂与其复方中的汞对机体的影响较小,没有影响MT-1和MT-2基因的表达,而HgCl2在体内的汞蓄积量远远高于其他组,故显著的诱导了MT-1和MT-2基因的表达,这也从一个侧面反映出HgCl2的毒性要远远高于朱砂及其复方。轻粉(Hg2Cl2),又名甘汞,也是中医常用的一种矿物药,外用有杀菌作用,内服可通利大便,其毒性亦不能与HgCl2相比。在本试验中,轻粉组小鼠肝肾组织中汞蓄积量要远远低于HgCl2组,其对MT-1和MT-2基因表达的诱导作用也弱于HgCl2,另外,对肝肾组织也无明显的病理损伤。轻粉虽与HgCl2的含汞量相同(Hg0.05g·kg-1),但由于它们的存在形式不同,从而导致其毒性要明显低于HgCl2。有学者研究报道,朱砂急性毒性很低,小鼠单次灌胃朱砂,即使剂量较大,也不会出现明显的毒性反应,梁爱华等报道一次性灌胃给予朱砂的最大耐受量达到24g·kg-1时,小鼠未出现死亡,也未出现呼吸抑制,抽搐等反应,解剖未见脏器异常病变。而在本试验中,当小鼠一次性给予16g·kg-1的朱砂时,就已经出现了汞蓄积量的增高和基因表达的改变,以及组织的损伤,这就说明,小鼠一次灌胃较大剂量的朱砂时,虽未出现死亡等明显的毒性反应,但是在机体内就已经出现了汞的蓄积和基因表达的改变。所以,虽然朱砂急性毒性很低,但是如果单次给药量过大,同样可以造成机体的损伤。丁国华等在研究大鼠口服朱砂的组织分布时,发现大鼠连续口服朱砂后,心脏、肝脏、肾脏及大脑中均有汞的蓄积,但是以肾脏中汞的蓄积量最高,梁爱华等在研究中发现,肾脏中汞的蓄积量要远远高于肝脏。文献报道认为含汞中药及其制剂对肾脏的损害最大,在本试验中,小鼠一次性灌胃朱砂后,肾脏中汞的蓄积量要高于肝脏,对肾脏的毒性也大于肝脏,这和以往的研究结果相符。近年来,有学者提出以总汞含量作为处方中朱砂的测定指标,并以HgCl2的毒性代表朱砂的毒性。在本试验中,H