Neon 细胞电转仪中文说明书(MPK5000)

...wd......wd......wd...一，简单的3步骤程序。1.将收集到的细胞和待转染的分子〔例如DNA，RNA，siRNA〕的混合物参加到提取物中。2.将带专用枪头的移液器插入带有电极杯的移液器座中;在设备上选择程序，然后按开场。3.拔下移液器，将转染的细胞转移到含有适当培养基的培养容器中。注：1.为了防止污染，强烈建议只使用电极杯10次。建议在切换到不同质粒DNA/siRNA或细胞类型时更换电极杯和缓冲液2.为了确保重复性和排除转染条件的变化，建议不要使用枪头超过2次二，软件操作程序1.按下电源开关〔位于设备反面，第vii页〕翻开Neon®设备。本机检查确保Neon®移液器站已连接到设备，然后显示启动屏幕。2.按Voltage启动数字键盘输入电压值。按所需的电压值，然后按Done保存该值。注意：如果任何输入值超出限制，则会显示错误信息，并自动设置最小的限制值。3.按Width激活数字键盘输入宽度值。按所需的宽度值，然后按Done保存该值。4.按Pulses激活数字键盘以输入脉冲值。按所需的脉冲值，然后按Done保存该值。5.如果要保存这些电穿孔参数，请按主屏幕上的“Save〞将程序保存在数据库中。6.按所需的程序号码编辑程序。选定的程序会突出显示。7.显示“Edit〞屏幕后，按键盘按钮输入用户名。光标自动移动到下一个字段协议，并突出显示为红色。继续输入Voltage，Width和Pulses信息。8。按Enter键将信息保存在数据库中。9.继续准备细胞和DNA，并设置用于电穿孔的移液器座三，细胞与DNA混合物准备本卷须知：1.将纯化的DNA重悬于1-5μg/μL浓度的去离子水或TE缓冲液〔10mMTrisHCl，1mMEDTA，pH8.0〕中。浓度可能因细胞类型而异。2.DNA量不应超过使用总体积的10％。3.通过测量A260/280比例来检查纯化的DNA制剂的纯度。电穿孔的比例应至少为1.8。4.该装置已经用4-7kb质粒进展常规测试，质粒高达约20kb不应该是问题。使用大于20kb的质粒很可能降低转染效率。5.不要用乙醇沉淀DNA以浓缩DNA。通过乙醇沉淀的浓缩DNA显示差的转染效率和由于盐污染导致的细胞活力。6.不含Ca2+和Mg2+的D-PBS或磷酸盐缓冲盐水〔PBS〕〔第40页〕流程：1.用3mL电解缓冲液〔使用缓冲液E，10μLNeon®Tip和BufferE2，100μLNeon®Tip〕填充电转杯。〔确保管子侧的电极完全浸入缓冲液中。〕2.将电极杯插入移液器座，直到听到咔嗒声。确保Neon®管的侧面电极与Neon®移液器站的侧球柱塞良好连接〔见以以下图左侧正确位置〕3.在电穿孔前一天，将细胞转移到具有新鲜生长培养基的培养瓶中，使得细胞在实验当天为70-90％集合。4.对于大多数优化协议，每10μLNeon®Tip可提供5×104-2×105个细胞。〔5×105-2×106个细胞每100μLNeon®Tip适用于大多数优化的方案。〕5.将含有血清，PBS〔不含Ca2+和Mg2+〕和胰蛋白酶/EDTA溶液的培养基的等分试样预温至37℃。从培养瓶中吸出培养基，并使用PBS〔不含Ca2+和Mg2+〕冲洗细胞。使用胰蛋白酶/EDTA或TrypLEExpress〔目录号12563〕对细胞进展胰蛋白酶消化。取一等份的胰蛋白酶化细胞悬浮液并计数细胞以确定细胞密度。将细胞转移到1.5mL微量离心管或15mL锥形管中，并在室温下以100-400×g离心细胞5分钟。通过在室温下以100-400×g离心5分钟，用PBS〔不含Ca2+和Mg2+〕清洗细胞。吸出PBS并以1.0×107个细胞/mL的最终密度将细胞沉淀重悬于ResuspensionBufferR中。轻轻移液细胞以获得单细胞悬浮液。防止在室温下储存细胞悬浮液超过15-30分钟，从而降低细胞存活力和转染效率。可以调整重悬细胞密度以适应电穿孔方案〔第18页〕或优化方案〔第24-29页〕的推荐细胞数。6.通过用含有血清和补充剂的0.5mL培养基将孔插入24孔板，不用抗生素，并在潮湿的37℃/5％CO2培养箱中预培养板。如果您使用其他培养板，请参见第18页电镀介质卷建议。7.对于每个电穿孔样品，下面列出了每孔的质粒DNA或siRNA的推荐量，细胞数量和电镀培养基的体积。使用再悬浮缓冲液T作为初级悬浮液8.使用3mL电解缓冲液〔使用缓冲液E，10μLNeon®Tip和缓冲液E2，100μLNeon®Tip〕装入Neon®移液管9.根据您的单元格类型在设备上设置所需的脉冲条件10.将适量的质粒DNA/siRNA转移到无菌的1.5mL微量离心管中。11.将细胞参加到含有质粒DNA/siRNA的管中，轻轻混合。请参见上表，了解细胞浓度，DNA和电镀量。12.要将Neon®Tip插入Neon®移液器，请将移液器上的按钮按到第二个停顿位置以翻开夹具13.将Neon®移液器的顶部插入Neon®Tip，直到夹具完全拿起活塞的安装杆〔见以以下图〕14.轻轻释放按钮，继续向移液器施加向下的压力，确保尖端密封在移液管上，没有间隙。注意：确保Neon®移液器和尖端严密连接，无间隙〔见左图〕，无故障移液和正确的电气连接15.将Neon®移液器上的按钮按到第一站，并将Neon®Tip浸入细胞DNA/siRNA混合物中。缓慢释放移液器上的按钮，将细胞DNA/siRNA混合物吸入Neon®Tip。在移液过程中防止气泡，因为气泡在电穿孔期间导致电弧，导致转染降低或失败。如果您注意到尖端中有气泡，请丢弃样品，并小心地将新鲜样品再次吸入尖端，无任何气泡。16.将带有样品的Neon®移液器垂直插入放置在Neon®移液器站中的Neon®Tube，直至听到咔嗒声。确保移液器突起插入吸液管的槽中。17.确保Neon®移液器的金属头与Neon®移液器支架内的球形活塞和Neon®Tube〔见左图所示的正确位置〕严密连接。18.在传送电脉冲之前，Neon®设备会自动检查Neon®Tube和Neon®Pipette是否正确插入。19.在电穿孔期间监测Neon®Tip，以查看是否有由于尖端存在气泡引起的电弧〔火花〕。电弧导致转染效率低，细胞活力低。20.交付电脉冲后，触摸屏上将显示“Complete〞以指示电穿孔完成。21.从Neon®移液器站慢慢移除Neon®移液器，并立即从Neon®Tip中将样品从移液器上按下第一个停留点，放入含有预热培养基的准备培养基中。22.我们强烈建议将电穿孔细胞加载到没有抗生素的生长培养基中，这可以大大降低转染后细胞的活力。23.要放弃Neon®Tip，请按第二个按钮的按钮进入适当的生物危险废物容器。24.对剩余的样品重复步骤7-16。使用两次后，请务必更换Neon®Tips，并在10次使用后更换Neon®Tubes。每个新的质粒DNA样品使用新的Neon®Tip和Neon®Tube25.轻轻摇动板，以确保细胞的均匀分布。在37℃下在加湿的CO2培养箱中孵育该板。注意1.如果您没有使用Neon®设备，将后面的电源开关转到OFF位置。2.防止在Neon®移液器台内溢出任何液体，以防止移液器台上的球塞上产生锈迹。3.如果您不小心将任何液体〔如缓冲液，水，咖啡〕溅入Neon®移液器站内，请将主机从主设备上断开，并用枯燥的实验室纸擦拭。倒置并允许车站在室温下完全枯燥24小时。优化流程1.确保您按照第16-17页所述制备细胞，使用DNA或siRNA，并制备含有0.5mL含有血清和无抗生素的培养基的24孔板，以转移电穿孔细胞。准备足够的细胞和质粒DNA/siRNA进展至少30次转染。2.对于使用24孔格式的10μLNeon®Tip的每个电穿孔样品，请参见下表。对于以24孔格式使用100μLNeon®Tip，请将下表中列出的数值适当调整10倍。3.使用3mL电解缓冲液〔将缓冲液E用于10μLNeon®Tip和缓冲液E2，100μLNeon®Tip〕置于含有细胞DNA/siRNA混合物的Neon®移液站中，如第15页所述。4.按优化和加载优化协议