氢溴酸高乌甲素在大鼠胃肠道的吸收动力学研究

氢溴酸高乌甲素在大鼠胃肠道的吸收动力学研究

氨基高吴甲素（也称为黄酮碱，谷氨酸lh）是毛护科高吴甲素植物的高刺激性生物。它是国内首创的非成毒性镇痛药物，用于治疗上述疼痛。本品具有较强的镇痛作用,与哌替啶相比镇痛效果相当,起效时间稍慢,而维持时间较长;镇痛作用为解热镇痛药氨基比林的7倍。毒理学本品动物实验无致畸胎作用。氢溴酸高乌甲素具有显著的抗炎消肿、降温解热与局部麻醉作用。临床上高乌甲素主要用于癌症疼痛的治疗以及术后镇痛。本研究组在氢溴酸高乌甲素口服片剂的药动学研究中发现该药口服给药生物利用度较低,因此研究该药在胃肠道各段的吸收部位特异性以及机理对于设计口服制剂以提高其生物利用度具有重要意义。本实验采用大鼠在体肠灌流的试验方法,考察氢溴酸高乌甲素在胃、小肠、结肠的吸收,了解该药在胃肠道的吸收特征,并考察了不同吸收促进剂对其吸收的促进效果及毒性,此外,还考察了P-糖蛋白抑制剂对药物小肠吸收的影响,为提高其口服生物利用度和开发口服制剂提供生物药剂学依据。材料表面1试剂及试剂用量氢溴酸高乌甲素(兰州制药厂产品,批号:20060602,HPLC纯度为97.2%);盐酸维拉帕米(江苏恒瑞医药股份有限公司)。乌拉坦(上海中秦化学试剂有限公司);甲醇(色谱纯,山东禹王实业有限公司);十二烷基硫酸钠(进口分装);去氧胆酸钠(上海中秦化学试剂有限公司);癸酸钠(进口分装);水为纯净水,其他试剂均为分析纯。Krebs-Ringer试剂(pH7.4,简称K-R试液)的配制:称取氯化钠7.8g,氯化钾0.35g,氯化钙0.37g,碳酸氢钠1.37g,磷酸二氢钠0.32g,氯化镁0.02g,葡萄糖1.4g,加纯水定容至1000mL,即得。人工胃液:按《中华人民共和国药典》2005年版二部附录配制。2长紫外过滤器Shimadzu高效液相色谱仪(包括SCL10Atvp系统控制器,SPDM10Avp可调波长紫外检测器,LC10Atvp输液泵,DGU12A脱气机,725I型手动进样阀,CTO10ASvp柱温箱,日本岛津公司);全自动电子分析天平(北京赛多利斯仪器系列有限公司);DDBT320型电子蠕动泵(上海之信仪器有限公司);UV1700紫外分光光度计(日本岛津公司)。3实验动物雄性SD大鼠,体重300g左右,购自兰州大学动物实验中心,许可证号:SCXK(甘)20050007。方法1试验溶液中氢溴酸高乌甲基素浓度的测定1.1高乌甲素对供试液、小鼠和胃吸收的干扰色谱柱:YMCPACKODS-A柱(150mm×4.6mm,5μm);流动相:甲醇-0.1mol·L-1磷酸二氢钠溶液(50∶50),流速:0.8mL·min-1;检测波长:252nm;柱温:40℃;进样量:20μL。取氢溴酸高乌甲素对照液及小肠和胃吸收供试液分别经0.22μm微孔滤膜,弃去初滤液,取续滤液20μL进样,在上述色谱条件下测定。色谱图见图1。由图1可见供试液与氢溴酸高乌甲素对照液的峰保留时间一致,空白液在此条件下无干扰。该法最低检测限为0.1μg·mL-1。1.2氢溴酸高乌甲基素浓度在肠道循环溶液中的测定1.2.1标准曲线的绘制分别精密吸取氢溴酸高乌甲素储备液(1g·L-1)0.05,0.1,0.15,0.2,0.25,0.3,0.4mL用K-R缓冲液定容至10mL,配成系列浓度的氢溴酸高乌甲素标准溶液,于0.22μm微孔滤膜过滤后,在上述色谱条件下进样20μL,以浓度(C)为横坐标,以峰面积(A)为纵坐标,绘制标准曲线。1.2.2回收率与所需资源量试验精密吸取氢溴酸高乌甲素储备液适量,用空白循环溶液稀释配制得5.0,20.0,40.0mg·L-1的3种不同浓度氢溴酸高乌甲素供试品溶液,进样20μL,在上述色谱条件下测定,记录色谱图与峰面积,代入标准曲线计算浓度。以测得浓度与实际浓度之比计算回收率。将上述配制的氢溴酸高乌甲素低、中、高3种浓度(5.0,20.0,40.0mg·L-1)的对照品溶液,按样品测定方法测定。以1d内测定的3次结果,计算日内精密度,3d内测定的3次结果计算日间精密度。1.3胃溶液中氢溴酸高乌甲基素浓度的测定1.3.1标准曲线的绘制精密量取氢溴酸高乌甲素储备液适量,用人工胃液稀释为所需系列标准液,0.22μm微孔滤膜过滤,精密吸取20μL进样分析,在上述色谱条件下测定,以峰面积(A)为纵坐标,以浓度(C)为横坐标,绘制标准曲线。1.3.2回收率试验精密吸取氢溴酸高乌甲素储备液适量,用空白循环溶液稀释配制得5.0,20.0,50.0mg·L-1的3种不同浓度氢溴酸高乌甲素供试品溶液,进样20μL,在上述色谱条件下测定,记录色谱图与峰面积,代入标准曲线计算浓度。以测得浓度与实际浓度之比计算回收率。将上述配制的氢溴酸高乌甲素低、中、高3种浓度(5.0,20.0,50.0mg·L-1)的对照品溶液,按样品测定方法测定。以1d内测定的3次结果计算日内精密度,3d内测定的3次结果计算日间精密度。2药物初始浓度和终浓度的计算选实验前禁食一夜(自由饮水)的大鼠,用20%乌拉坦腹腔注射麻醉(200mg·kg-1)麻醉大鼠,切开腹部,暴露胃,将贲门结扎,用玻璃插管插入幽门结扎之,用人工胃液将胃腔洗净,注射器内吸取胃试液10mL,注射4～5mL到胃内,然后又抽回到注射器重复几次,使混合均匀,最后全部抽入注射器中,最后将4mL上述混合均匀的药液注入胃内,注射器内留下的药液浓度为药物初始浓度(C0),2h后从胃抽出药液的浓度为药物终浓度(Ct),根据氢溴酸高乌甲素初始浓度和终浓度计算其吸收率。3k-r样品的制备将实验前禁食18h的大鼠称重后,用20%乌拉坦腹腔注射麻醉(200mg·kg-1)麻醉大鼠,麻醉后将大鼠背位固定于手术台板上,用白炽灯加热保持37℃体温,沿腹部正中线切开腹部(约3cm)。对需要考察的部位,在两端剪切后插管,结扎,先用少量37℃的生理盐水冲洗肠段,再用空气将生理盐水排净。取供试液(预热至37℃)100mL(记为V0),以2.5mL·min-1的流速循环10min后开始计时,分别于回流0.25,0.5,0.75,1.0,1.5,2.0,3.0,4.0h取样0.3mL,同时补充等量的等温K-R溶液。样品经0.22μm微孔滤膜过滤,高效液相色谱法测定灌流液中药物的浓度。实验结束后,用空气排出肠道内残留的药液,测量灌流液的体积计为Vt。3.1药物吸收百分率测定实验结束后,小肠灌流液的体积有明显的减少,为了准确地计算吸收速率常数,通过校正灌流液的体积便可以更准确的计算得浓度。有文献报道水分在肠道内的吸收可以被描述为近似的零级动力学过程。待测溶液的初始体积(V0)是确定的,试验结束后分别测定每只大鼠灌流液的末体积(Vt)。根据灌流液的初末体积计算出每个取样点供试液的体积,根据每个时间点药物浓度和供试液体积计算出肠循环液中的剩余药量Xr,以lnXr对取样时间作图得一直线,由直线的斜率求出吸收速率常数(Ka);由4h剩余药量的变化值对初始药量的比求出4h药物吸收百分率。lnXr=lnX0-Ka×t吸收百分率/%=(V0C0-VtCt)/V0C0×1003.2药物在各个肠段吸收速率的测定将浓度为20mg·L-1的氢溴酸高乌甲素供试液100mL,按上述方法操作,进行大鼠十二指肠、空肠、回肠、结肠循环实验,4h后考察药物在各个肠段的吸收状况。计算吸收速率并进行t检验。分段考察的各肠段区间如下:十二指肠段自幽门1cm处开始往下10cm止;空肠段自幽门15cm起往下10m止;回肠段自盲肠上行20cm开始往下10cm止;结肠段从盲肠后端开始往下10cm止。整肠段考察自十二指肠上端起到回肠下端止。3.3药物浓度对肠吸收的影响用K-R溶液将药物配制成浓度为10,20,40mg·L-1的供试品溶液,沿整肠段回流4h,依照“3”项下进行操作,考察药物浓度对肠吸收的影响。3.4p-糖蛋白抑制剂对药物小鼠吸收的影响用K-R溶液将药物配制成浓度为20mg·L-1的供试品溶液,加入100μmol·L-1的盐酸维拉帕米作为P-糖蛋白抑制剂,沿整肠段回流4h,依照“3”项下进行操作,考察P-糖蛋白抑制剂对药物小肠吸收的影响。3.5灌流液中药物浓度对药物吸收的影响将十二烷基硫酸钠(SDS),去氧胆酸钠(SDC),癸酸钠(SC)作为吸收促进剂分别加入灌流液,使其在灌流液中的浓度达到0.2%(0.2g/100mL),药物浓度均为20mg·L-1,沿整肠段灌流4h,测定药物的吸收状况。实验完毕后,取下实验肠段,用K氏液冲洗后,4%的甲醛固定,垂直切片,用苏木紫-曙红染色后,电子显微镜观察。4试验液的稳定性测定同上述方法操作,用K氏液在循环装置中灌流4h,得空白肠循环液,以此空白肠循环液配制含氢溴酸高乌甲素20mg·L-1小肠循环液,置(37±0.5)℃水浴中孵育,分别于0,1,2,3,4h取样,测定峰面积。结果显示,4h测得供试液中LH的平均含量为0时刻的(100±1.52)%,说明4h内氢溴酸高乌甲素在肠循环液中稳定。为考察胃吸收过程中药物的稳定性,以人工胃液配制含氢溴酸高乌甲素20mg·L-1的供试液,置(37±0.5)℃水浴中孵育,分别于0,0.5,1,1.5,2h取样,测定峰面积。结果表明2h内氢溴酸高乌甲素在胃灌注液中稳定,RSD为0.98%。结果1回收率及精密度人工胃液中氢溴酸高乌甲素的标准曲线方程为A=20701C-165.8(r=0.9997),结果表明,氢溴酸高乌甲素在5～50mg·L-1内线性关系良好。高(50.0mg·L-1)、中(20.0mg·L-1)、低(5.0mg·L-1)浓度的平均回收率分别为97.78%,100.59%,100.78%(n=3);日内精密度为0.41%,0.15%,0.02%(n=3);日间精密度为1.80%,1.40%,0.76%(n=3)。2回收率、精密度与定量限K-R缓冲液中氢溴酸高乌甲素的标准曲线方程为A=22660C+280.27(r=0.9998),结果表明,氢溴酸高乌甲素在5～40mg·L-1内线性关系良好。高(40.0mg·L-1)、中(20.0mg·L-1)、低(5.0mg·L-1)浓度的平均回收率分别为99.88%,98.26%,98.24%(n=3);日内精密度为0.50%,0.36%,0.21%(n=3);日间精密度为2.63%,1.85%,1.53%(n=3)。3物吸收百分率测定大鼠在体胃吸收实验2h后,求出药物吸收百分率。由表1可见,氢溴酸高乌甲素在大鼠胃中2h仅吸收9.67%,胃部为该药物吸收的不良部位。4药物在肠道的吸收4.1不同肠段氢溴酸高乌甲素吸收部位的检测氢溴酸高乌甲素溶液在各肠段的吸收速率常数(Ka)和吸收百分率(%)见表2。十二指肠是氢溴酸高乌甲素较佳的吸收部位,与其他肠段比较均有显著性差异(P<0.05);而空肠与回肠之间无显著性差异(P>0.05),它们的吸收速率相近,结肠吸收最差。4.2循环前后的吸收量和吸收速率和速率常数高中低3个浓度的供试品溶液,沿整肠段回流4h后,求出不同浓度药物循环后的吸收量和吸收速率常数,结果见表3。结果表明,在10～40mg·L-1内药物的吸收量与质量浓度呈正相关,没有饱和吸收现象,并且吸收速率常数几乎保持不变,初步判断其吸收有可能是被动扩散的结果。4.3p-糖蛋白抑制剂对段小鼠吸收速率的影响小肠灌流液中加入P-糖蛋白抑制剂后,氢溴酸高乌甲素溶液在整段小肠内的吸收速率常数(Ka)和吸收百分率(%)见表4,结果表明,P-糖蛋白抑制剂组增加了药物的小肠吸收,原药组和P-糖蛋白抑制剂组的吸收百分率具有显著性差异(P<0.05)。4.4对药物的吸收与中浓度药物在大鼠小肠内吸收的实验结果相比,吸收促进剂十二烷基硫酸钠、胆酸钠和癸酸钠对药物在小肠内的吸收具有明显的促进作用(P<0.01)。三者促进药物吸收的倍数分别是1.29,1.31,1.53倍。结果见表5。4.5组织病理学检测吸收促进剂对小肠黏膜毒性较大,为了评价本实验中用到的促透剂毒性大小,将实验肠段进行常规处理后,进行组织病理学评价。结果发现,十二烷基硫酸钠和去氧胆酸钠对小肠黏膜造成了不同程度的改变,如小肠绒毛脱落和倒伏,小肠上皮细胞脱落,炎性细胞增加。相比之下,癸酸钠对小肠黏膜造成的毒性最小,结果见图2。优化药物生物利用度在体小肠吸收实验中,由于肠道吸收水分导致灌流液体积减少,因此,进行药物吸收动力学的研究时为了标示灌流液体积变化,国内常采用酚红作为标记物。一般的肠吸收理论中认为:酚红为一离子型化合物,在小肠内不吸收。但有文献报道酚红可以从小肠吸收,平均吸收速率约6%,1.0mmol·L-1酚红(pH6.5磷酸缓冲液)能从小肠吸收,并在1h血药浓度达峰值3nmol·mL-1,因此不能用酚红来标示在体小肠吸收模型中灌流液的体积变化,否则将导致药物吸收速率偏小,尤其是难吸收药物,有时将得出错误的结论。本研究的创新之处在于采用了与以往文献所报道的不同的方法,用体积法校正水分的吸收,此方法较简单,且得出的结果更为准确。十二指肠为氢溴酸高乌甲素的最佳吸收部位,提示可应用制剂学方法控制氢溴酸高乌甲素在十二指肠的滞留时间,以提高其吸收程度,从而提高其生物利用度。本研究还得出P-糖蛋白抑制剂维拉帕米可增加药物从小肠的吸收,因此在临