生化分离大题

1、c简述纯水的制备工艺1） 树脂：阳树脂（强酸性X阴树脂（强碱或弱碱，弱碱不能除去弱酸性阴离子硅酸，碳酸）2） 串联床：强酸-弱碱、强酸-强碱-弱酸、强酸-弱碱-强酸-强碱、强酸-强碱-混合床3） 混床可以看成是由许多阴、阳离子交换树脂交错排列而成的多级式复床。一般混床采用强酸阳离子交换树脂和强碱阴离子交换树脂。特点：脱盐效果好、避免脱盐过程中pH变化、再生不方便2、层析分离的基本原理：利用多组分混合物中各组分物理化学性质的差别，使各组分以不同的程度分布在两个相中的物理方法。根据实验技术的分类：低压层析技术、中压层析技术、高压层析技术电泳法根据固定相的形状不同的分类：柱层析法、纸层析法、薄层层析法 根据流动相的物态不同的分类汽相层析法、液相层析法、固相层析法层析的分类:：根据作用机理不同分：吸附层析法、分配层析法、凝胶过滤法3、 c错流过滤|：又称切向流过滤，在压力推动下，悬浮液以高速在管状滤膜的内壁作切向流动，利用流动的剪切作用将过滤介质表面的固体（滤饼）移走，而附着在滤膜上的滤饼很薄，因而能在长时间内保持稳定不变的过滤速度4、 错流过滤特点：优点：收率高、质量好、减少处理步聚、染菌罐也能进行处理缺点：介质阻力大、不能得到干滤饼5、 CO2超临界萃取的优点：|临界条件温和；产品分离简单；优良的传质性能;扩散系数大；粘度低；无毒、无害、无腐蚀、不燃；价格便宜；根据分离目的可获得萃取物、萃余物。6、 |蛋白质的溶解模型：（|1）水壳模型：蛋白质位于水池的中心，周围存在的水层将其与反胶束壁隔开；（2）半岛模型：pro表面存在强烈疏水区，该区直接与有机相接触。（3）pro吸附于反胶束内壁（4）pro疏水区与几个反胶束的S疏水尾发生相互作用，被几个小反胶束所“溶解”。7、 蛋白质电泳常用的方法有哪些？（一） 纸电泳 指用滤纸作为支持载体的电泳方法。是最早使用的区带电泳。（二） 醋酸纤维素薄膜电泳电泳时经过膜的预处理、加样、电泳、染色、脱色与透明即可得到满意的分离效果。此电泳的特点是分离速度快、电泳时间短、样品用量少。因此特别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测。（三） 凝胶电泳以凝胶物质作支持物进行电泳的方式，被称为凝胶电泳。普通的凝胶电泳在板上进行，以凝胶作为介质。电泳中常用的凝胶为葡聚糖、交联聚丙烯酰胺和琼脂糖（四） 等电聚焦电泳等电聚焦电泳过程一种利用有pH值梯度的介质，分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。（五） 等速电泳采用两种不同浓度的电解质组成，一种为前导电解质，充满整个毛细管柱；另一种为尾随电解质，置于一端的电泳槽中。（六） 双向凝胶电泳（二维电泳）（七）免疫电泳免疫电泳是琼脂平板电泳和双相免疫扩散两种方法的结合。8、 f反胶束应用于蛋白质萃取的优点|：①有很高的萃取率和反萃取率并具有选择性；②分离、浓缩可同时进行，过程简便；③能解决蛋白质（如胞内酶）在非细胞环境中迅速失活的问题；④表面活性剂往往具有细胞破壁功效，可直接从完整细胞中提取具有活性的蛋白质和酶；⑤成本低，溶剂可反复使用等。需要大的膜面积、目前适用于小分子的分离。9、 f防止膜污染的方法：①进料液的预处理：预过滤、pH及金属离子控制；②选择合适的膜材料：减轻膜的吸附；③改善操作条件：加大流速。110、g高表达产生的积聚物在细胞内部形成不溶物原因?蛋白过量积聚，超过溶解度，导致沉淀;蛋白生成太快，分子间疏水基团相互作用而聚集沉淀；蛋白生成太快，分子内部二硫键的错误连接导致沉淀；表达蛋白过多，与其结合/诱导组分不足，不能形成溶解状态11、 g固液分离的方法有哪些？各有何优缺点。过滤filtration过滤操作是借助于过滤介质，在一定的压力差AP作用下，使悬浮液中的液体通过介质的孔道，而固体颗粒被截留在介质上，从而实现固液分离的单元操作。离心应用（1）难过滤的发酵液：对于浓度较小，粒径较大，硬度较强的不溶物，可以采用过滤分离。忌用助滤剂、或助滤剂无效的悬浮液。（2）互不相溶液一液分离液液萃取（3）不同密度固体或乳浊液的密度梯度分离超：离心分离。缺点：（1）分离得到的不是滤饼一样的半干物，而是浆状物；（2）处理量小（3）设备复杂，价格贵，分离成本高。膜分离membraneseparation用半透膜作为选择障碍层，利用膜的选择性（孔径大小），以膜的两侧存在的能量差作为推动力，允许某些组分透过而保留混合物中其它组分，从而达到分离目的的技术。膜分离的特点①操作在常温下进行；②是物理过程，不需加入化学试剂；③不发生相变化（因而能耗较低）；④在很多情况下选择性较高；⑤浓缩和纯化可在一个步骤内完成；⑥设备易放大，可以分批或连续操作。双水相萃取ATPS利用物质在不相溶的，两水相间分配系数的差异进行萃取的方法。又称双水相分配法特点（1）保留产物活性。（2）不存在相的分离。（3）溶液分相不依赖有机溶剂。（4）固液分离。12、 j基因工程包涵体的纯化方"收集菌体细胞一细胞破碎一包涵体的洗涤…目标蛋白的变性溶解…目标蛋白的复性13、 l离子交换层析机理|：通过带电的溶质分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换而达到分离纯化的方法。分五个步骤：（1）开始在树脂中加入样品，；（2）树脂与样品进行吸附;（3）加入解吸剂使其解吸;（4）解吸结束后加入再生剂；（5）树脂再生。14、 l林可霉素性质：碱性抗生素，分子中有一个胺基pK=7・6；pH<2・0的溶液中不稳定；盐酸盐易溶于水，游离碱在水中溶解度较小，易溶于有机溶剂，如醇类（甲醇、乙醇、异丙醇、、丁醇）；酯类（乙酯，丁酯）；酮类（丙酮、甲乙酮）等，醇类中溶解性比酯和酮类中好。（1） .设计提取工艺路线:能否用萃取法提取？选用什么溶剂最好？理由？萃取时pH范围？欲提高分配系数，可采取什么措施？如需进一步反萃取，考虑反萃取的pH范围。原因？（2） .若采用二级逆流萃取，a=3,K0=15.56，求萃取的理论收率。1.a.萃取法适用于弱酸弱碱性物质Lin—pK=7.6弱碱性物质，不同形态时溶解度不同。选丁醇，原因：①醇类中溶解度最大②丁醇C链长，与水互溶度小。pH>7.6，Lin游离分子浓度f当pH10.0时,C0=99.6%C+=0.4%.\选pH10pH再升高是否更好？Lin几乎都呈游离分子，溶解度不会再增大；且耗碱量多被同时萃取的碱性杂质f,分离效率ILin稳定性受影响

加NaCl,盐析作用:①水中溶解度进一步IKf(18—28)②两相互溶度I易分层。反萃pH:2.0<pH<7.6原因pH<7.6:Lin电离度大“+”易溶于水pH>2.0:Lin稳定性。2.二级逆流萃取a=3 K0=15.56甲一E一K_1+10注-冲_1+10注-冲1556 =1551+10’T。■的优点：的优点：可应用于(1)难过滤的发酵液(2)互不相溶液一液分离液液萃取(3)，浊液的密度梯度分离超缺点：(1)分离得到的不是滤饼一样的半干物，15、 L离心分离L-不同密度固体或乳而是浆状物；(2)处理量小；(3)设备复杂，价格贵，分离成本高。16、l掌握离子交换的基本步骤 .一树脂的选择' I 匚II.•交联度的选择 根据生化物质分子量考虑。 、’,原则：在不影响交换容量的前提下尽量增大交联度。I树脂的型式：阳树脂：H型、盐型(Na+NH4+)阴树脂：OH型、盐型(Cl—)。树脂预处理-物理处理：水洗•、过,筛，去杂，以获得粒度均匀的树脂颗粒；-化学处理：转型阳离子树脂酸一碱一酸阴离子树脂碱一酸一碱最后以去离子水或缓冲液平衡离子交换吸附溶液中待交换离子与树脂上的活性离子发生交换反应的过程，使尽可能多的待交换离子吸附到树脂上，同时保证其选择性洗脱洗脱一般采取梯度淋洗：先采用洗脱能力弱的溶液，使易洗脱组分流出，然后依次使用洗脱能力更强的溶液，洗脱较难洗脱的组分。可以通过1)改变溶液pH值2)改变溶液离子强度再生离子交换树脂(IONRESIN)使用一段时间后，吸附的杂质接近饱和状态，就要进行再生处理，使之恢复原来的组成和性能17、 m膜分离的特点：①操作在常温下进行；②是物理过程，不需加入化学试剂；③不发生相变化(因而能耗较低)；④在很多情况下选择性较高；⑤浓缩和纯化可在一个步骤内完成；⑥设备易放大，可以分批或连续操作。18、 n浓差极化-凝胶层模型:当发生浓差极化后，膜面上浓度Cw大于主体浓度Cb，溶质向主体反扩散；当溶质向膜面的流动速度与反扩散速度达到平衡时，在膜面附近存在一个稳定的浓度梯度区，这一区域称为浓度极化边界层；在边界层中取一微元薄层，对此微元薄层作物料衡算。推导边界层形成后，通量与Cw及Cb的关系。|19、m膜污染的表现：|一是膜通量下降；二是通过膜的压力和膜两侧的压差逐渐增大；三是膜对生物分子的截留性能改变。m膜污染的清洗方法：|物理法：海绵球擦洗、热水法、反冲洗和循环清洗化学法：选择清洗剂要注意三点：1.要尽量判别是何种物质引起污染；2.清洗剂要不致于对膜或装置有损害;3.要符合产品要求。化学法常用的清洗剂有：NaOH、酸、表面活性剂、氧化剂、酶、有机溶剂20、pH对表观分配系数的影响(pH~K)：]pH低有利于酸性物质分配在有机相，碱性物质分配在水相。对弱酸随pHlKf,当pH<<pK时，K-K0由萃取机理和k~ph的关系可得出如下结论：酸性物质碱性物质萃取pH<pKpH>pK反萃取pH>pKpH<pK控制pH,去除杂质：⑴碱性杂质 pKpen<pK碱杂 当pH<pKpen(2.75)pH<<pK碱杂碱性杂质呈正离子状态，易溶于水相中，..・自然分离除去(2)酸性杂质pK酸杂<pKpen pH控制:pK酸杂负离子(3)酸性杂质 pK酸杂>pKpen21、p选择破碎方法的依据：|细胞处理量;细胞壁强度和结构(高聚物交联程度、种类和壁厚度)；目标产物对破碎条件的敏感性；破碎程度；目标产物的选择性释放22、q为什么青霉素在酸性(pHW2.5)条件下，而红霉素却要在碱性(pHN9.8)条件下才能被萃取到丁酯中去呢？_青霉素 红霉素酸碱性pHvpKpH>pK弱酸性(2.75) 弱碱性(9・4)游离分子 “+”“-” 游离分子根据表观分配系数公式可知，弱酸的表观分配系数：K=K0/(1+10pH—pK)弱酸的表观分配系数：K=K0/(1+10pK—pH)对于弱酸：pH<pK时，分配系数大对于弱碱：pH>pK时，分配系数大不同pH条件影响弱电解质电离，从而影响分子的极性，根据相似相溶原则，在弱极性的丁酯中极性小的分子溶解度比水中大，故从水相转入丁酯相中，而发酵液中存在的其它杂质由于极性情况与抗生素不同，故很少进入丁酯中，这样就达到一定程度的纯化。23、q将青霉素由水相萃取到丁酯相中，其pK=2・75，萃取条件：pH=2・5,T=10°C，VF：VS=1：1，测得萃取前发酵液(水相)效价20000u/ml，平衡后废液效价645・2u/ml，求分配系数K和K0。青霉素为弱酸性电解质：k0=萃取相浓度/萃余相浓度=31弱酸的表观分配系数：K=K0/(1+10pH-pK)=11.16R24、溶解一扩散模型:认为膜是均匀的，无孔，水和溶质分两步通过膜：第一步：首先吸附溶解到膜材质表面上；第二步：在膜中扩散传递(推动力为化学位梯度)，扩散是控制步骤，服从Fick定律，推导出溶剂和溶质透过膜的速度公式25、s生物技术下游加工过程的选择准则：|(1)尽可能简单、低耗、高效、快速（2）采用步骤应最少（3）避免同一原理的多次出现（4）尽量减少新化合物的进入待分离的溶液（5）合理的分离步骤次序26、生物技术下游加工过程的发展动向:①基础理论研究：选择性分离剂、数学模型②应用研究：提高分离过程选择性、开发新介质、提高分离纯化技术③工程问题研究④改善环境相容性S27、|双水相萃取技术的应用|：1）目前较多地应用于胞内酶的提取和精制上。2）.用双水相萃取技术处理细胞匀浆液，既可方便地除去细胞碎片，还可使酶得到精制。通常将目的蛋白质分配在上相（PEG），而细胞碎片分配在下相（盐）。3）.萃取操作时单位重量相系统中匀浆液的加入量一般每1kg萃取相系统以处理200〜400g湿菌体为宜。28、x细胞破碎技术：（1）机械破碎：捣碎法、研磨法、匀浆法、超声法（2）物理破碎：温度差破碎法、压力差破碎法（3）化学破碎：有机溶剂、表面活性剂、剂酸碱4）酶促破碎：自溶法、外加酶制剂法29、x吸附的类型有哪些？固定床吸附：固定床吸附是吸附分离操作中常采用的设备.膨胀床吸附：膨胀床是发展中的吸附分离技术.在蛋白质类生物大分子的单步纯化分离过程有着诱人的开发潜力.特点：1）兼有固定床和流化床的优点，流化的固相介质基本可以悬浮在床内的固定位置，流体流动状态以平推流的方式流经床层.2）集料液澄清、目标产物浓缩和分离纯化为一体的生物集成分离技术.还有盐析吸附、离子交换吸附、亲和吸附、染料配位体吸附、免疫吸附、固定金属螯合吸附、羟基磷灰石吸附Y30、预处理的目的：|⑴改变发酵液的物理性质，包括增大悬浮液中固体粒子的尺寸，降低液体黏度。促进从悬浮液中固形物的分离速度，提高固液分离的效率。⑵相对纯化，去除发酵液