基于pcr技术的地方猪种黑素皮质素受体1的位点分析

基于pcr技术的地方猪种黑素皮质素受体1的位点分析

动物的彩色表面主要由黑色素皮质素受体1（mc1r）引起的不同等位基因调整组成。MC1R为G蛋白耦合受体,有7个跨膜功能域,其天然配体为黑素皮质素激素肽。MC1R在黑色素细胞中表达,与天然配体α-促黑素细胞激素(α-MSH)相互作用,经由G蛋白耦合的cAMP信号通路,调节黑色素细胞内的一系列级联反应,最终经多巴或多巴铬合成各自的衍生物-褐黑素细胞和真黑色素,在动物中呈现不同的毛色或羽色。猪MC1R基因定位于6号染色体短臂末端,靠近端粒区,由948bp的单一外显子构成。目前,已知猪MC1R基因存在5个等位基因:E+对应于野猪的野灰毛色表型;ED1对应于欧洲大黑猪和中国梅山猪的黑毛色表型;ED2对应于汉普夏的黑毛色表型;Ep对应于皮特兰的斑块表型;e对应于红毛杜洛克表型。我国猪种资源丰富,毛色各异,如乌云盖雪式(黑背白腹)的万安花猪、白带表型(头尾黑,中间白)的金华猪等。为研究我国地方猪种MC1R基因对毛色表型的调控,本研究选用16个全同胞家系,采用PCR-RFLP、PCR-SSCP技术手段,得到MC1R座位对毛色决定作用的一些认识;同时,采用PCR-RFLP和PCR-SSCP技术手段相结合,检测了6个地方品种:两头乌(金华猪、上高两头乌)、黑猪(玉山黑猪、嘉兴黑猪)、花猪(乐平花猪、嵊县花猪)MC1R座位等位基因分布频率及基因型频率,首次在嵊县花猪中发现一个PCR-SSCP证据的MC1R基因新序列。1材料和方法1.1种猪及牧良种场耳组织样来自16个全同胞家系和6个地方猪种,16个全同胞家系情况见表1。6个地方猪种为:金华猪58头,采自浙江省金华市种猪场;嘉兴黑猪57头,采自浙江省嘉兴市畜牧良种场;上高两头乌45头,采自江西省上高县畜牧良种场;乐平花猪32头,采自江西省乐平市畜牧良种场;玉山黑猪55头,采自江西省玉山县畜牧良种场;嵊县花猪58头,采自浙江省嵊州市畜牧良种场。采样方式为随机抽样。1.2耳组织的dna提取按照常规酚/氯仿抽提法提取基因组DNA。1.3pcr-bsph-rflp分析引物MC1R1根据Kijas提供序列合成,扩增MC1R位点3′端405bp片段,用于PCR-AccⅡ-RFLP分析;引物MC1R2根据Kijas提供序列合成,扩增MC1R位点5′端428bp片段,用于PCR-BspHⅠ-RFLP分析;引物MC1R3根据MC1R基因序列(GenBank),Oligo4.0分析软件设计引物,扩增含AccⅠ酶切位点的184bp片段。引物序列为:MC1R3-F:5′-CGC,TCA,TGG,CGG,TAC,TGA,A-3′;MC1R3-R:5′-GGA,GAG,GTG,CAG,GAA,GAA,GG-3′。1.4pcr-acc-rflp的基因型判定根据引物MC1R1的PCR-AccⅡ-RFLP和引物MC1R2的PCR-BspHⅠ-RFLP的检测结果,初步确定个体的MC1R基因型(表2);再进一步利用引物MC1R3的PCR产物进行SSCP分析,以最终确定具体的MCIR基因型(表3)。例如,某个体PCR-AccⅡ-RFLP的酶切带型为3条带,PCR-BspHⅠ-RFLP的酶切带型为1条带的基因型有E+/ED1、E+/e两种可能;再根据该个体引物MC1R3的SSCP带型进行具体基因型判定。如表3所示,若PCR-SSCP带型兼有大白猪和梅山猪的SSCP带型,则综合PCR-SSCP和PCR-BspHⅠ-RFLP、PCR-AccⅡ-RFLP分析结果,该个体仅有E+/ED1一种可能。PCR-SSCP分析采用15%的非变性聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺:N,N’-亚甲基双丙烯酰胺=49∶1)。2μlPCR产物加入10μl上样缓冲液[98%甲酰胺、0.5mol/LEDTA(pH8.0)、0.05%二甲苯青FF、0.05%溴酚蓝],混匀后,98℃变性5min后上样,4℃7V/cm电压电泳。电泳后银染显带观察结果。2结果2.1p、33b叶片AccⅡ-RFLP酶切后得到405bp、222bp、183bp3条片段(图1);BspHⅠ-RFLP酶切后得到428bp、256bp、172bp3条片段(图2)。2.2sscp带型与基因型的关系经SSCP电泳后可见等位基因ED1、e与E+、EP、ED2带型相异,而E+、EP、ED2带型相同,部分个体的SSCP带型与基因型关系如图3所示。嵊县花猪中新发现一特异序列,如图4箭头所示。2.3mc1r给药回收单猪mc1r排放系统mc1r本研究采用PCR-RFLP和PCR-SSCP技术手段相结合,检测了两头乌(金华猪、上高两头乌)、黑猪(玉山黑猪、嘉兴黑猪)、花猪(乐平花猪、嵊县花猪)等3类毛色表型6个地方猪种的MC1R座位等位基因分布频率及基因型频率(表4)。2.4基因型的检测本研究对16个全同胞家系的MC1R位点运用PCR-RFLP和PCR-SSCP方法检测基因型,并对毛色表型进行分析。本文选取一典型家系的分析结果如表5所示。3基因型的确定利用PCR-SSCP和PCR-RFLP相结合的方法分析地方猪种的MC1R基因型,因外来猪种的MC1R基因型已知,根据分离规律即可得到家系后代的基因型,简化了毛色分析的复杂性。皮特兰与二花脸家系子代个体基因型为ED1/EP时,毛色为全黑;从表5可以看出,杜长南家系的6号个体基因型为ED1/e,毛色为全黑。这些结果进一步验证了Legault、Kijas等人的结果:ED1对EP、e为完全显性。有些个体基因型虽相同,但表现出白色斑块,则可能这些个体的显性白毛调控基因(KIT位点)不为隐性纯合状态。表5中的5号、8号个体基因型为EP/e,毛色表型既呈现出EP的斑点,斑块表型又呈现出e的红毛色表型,可见EP对e为不完全显性。从地方猪种基因型频率的计算结果来看,ED1在不同地方猪种间占有显著频率:金华猪的ED1基因频率为1;上高两头乌为0.9608;嘉兴黑猪为0.9368;玉山黑猪为0.9603;嵊县花猪中为0.8708;乐平猪为0.7656。这说明我国地方猪种的黑毛色可能主要由显性黑等位基因ED1调控。这些数据从侧面也反映金华猪在所测品种中毛色基因最纯,乐平花猪有较多非品种血源渗入;除金华猪外,外来猪种特有的ED2、EP等位基因在所测地方品种中均有一定频率,表明一些在外来猪种中发现的等位基因在中国地方猪种也存在;E+等位基因在某些品种内的少量存在似乎表明这些品种在由野猪驯养成家猪过程中,毛色表型上受到较少的选择。PCR-SSCP分析嵊县花猪基因型时,发现两特异条带。该特异条带的出现有可能源于曾对我国地方猪种改良起过贡献的巴克夏猪、苏白猪、克米洛夫猪中特有的等位基因;或是在长期选择过程中形成的对毛色表型无影响的突变,可进一步测序比较ES与其他等位基因的序列异同。MC1R位点的基因型检测有利于种猪纯度的鉴别。例如,大白猪如果与杜洛克猪杂交,由于KIT位点的显性上位作用,杂交子代仍为白毛色,购买者不一定能从外形上判定出它为杂种;如果能对MCIR位点进行检测,则从基因型上可以容易地作出判断,因为纯种大白猪MC1R位点的基因型为EP/EP,大