洛阳市野生珊兰基因组dna提取方法的比较研究

洛阳市野生珊兰基因组dna提取方法的比较研究

爱兰科兰科的地生草本植物。蕙兰是我国珍稀物种,为国家二级重点保护野生物种。蕙兰原分布于秦岭以南、南岭以北及西南广大地区,是比较耐寒的兰花品种之一。在秦巴山区不少地方均有分布,商洛一带兰花的分布也很广泛,其中就有蕙兰。DNA是分子研究的基础物质,其提取技术则成为分子生物学的基本技术1材料和方法1.1材料预处理野外采集商洛野生蕙兰幼嫩叶片,蒸馏水洗去尘土,晾干,放入-20℃冰箱预冷备用。1.2电泳仪成像系统主要仪器:人工气候箱、超低温冰箱、制冰机、紫外分光光度计、电子天平、高压灭菌锅、超纯水仪、移液器、核酸电泳仪、恒温水浴锅、水平电泳槽、凝胶成像系统等。主要试剂:SDS(十二烷基磺酸钠)、CTAB(十二烷基溴化氨)、EDTA(乙二胺四乙酸)、氯化钠、β-巯基乙醇、氯仿/异戊醇、异丙醇、RNaseA、Tris-HCl、醋酸钾、琼脂糖、溴酚蓝、MarkerDL2000、蔗糖、硼酸、无水乙醇等。1.3溶液制备1.3.1ph值的测定将12.11gTris碱溶于80mL超纯水中,待溶液冷却至室温后,用浓盐酸调定pH值至8.0,定容至100mL后,分装、高压灭菌,室温保存备用。1.3.20.5moll将18.61gEDTA-Na1.3.35moll将29.22gNaCl溶于80mL超纯水中,定容至100mL,分装后高压灭菌,室温保存备用。1.3.450%p溶液25gPVP(相对分子质量10000)溶于80mL超纯水中,定容至100mL,高压灭菌,室温保存备用。1.3.510ctag将14mL5mol·L1.3.6ph值的确定40mL去离子水中加40.81g三水合乙酸钠,用冰醋酸调pH值至5.2,再加稀醋酸定容100mL,高温灭菌,室温保存备用。1.3.710gl取RNaseA100mg、1mol·L1.3.810%sds溶液将10gSDS溶于80mL超纯水中,定容至100mL,分装后高压灭菌,室温保存备用。1.3.9sds提取缓冲液已配制将1mol·L1.3.102：提取缓冲液已配制将1mol·L1.3.11.高盐2ctag提取缓冲液现用将1mol·L1.3.12体缓冲液ph值8.0将1mol·L1.3.135tetris-硼酸电泳缓冲液称27gTris碱,13.75g硼酸,加入0.5mol·L1.4提取dna的方法1.4.1sds法称取0.2g样本用液氮研磨成粉,加入lmL提取液(500mmol·L1.4.2研钵、细粉、保温取0.2g植物材料,双蒸水洗净,并用滤纸吸干;植物材料剪成1cm左右碎片,放入预冷的瓷研钵中。加入液氮速冷,研磨成细粉(越细越好);在5mL离心管中加入抽提缓冲液1mL,65℃保温1h;15000r·min1.4.3研钵、细粉、保温取0.2g植物材料,双蒸水洗净,并用滤纸吸干;植物材料剪成1cm左右碎片,放入预冷的瓷研钵中;加入液氮速冷,研磨成细粉(越细越好);在5mL离心管中加入抽提缓冲液1mL,65℃保温1h;15000r·min1.5提取dns质量的测试1.5.1琼脂糖凝胶电泳将不同方法提取所得的DNA溶液各取5μL,与1μL载样缓冲液(LB)混匀后,在0.8%琼脂糖凝胶中电泳,电泳缓冲液为0.5×TBE液,电压为80V。待混合液蓝色条带迁移适当距离(一般为距加样孔3~5cm处)时停止电泳,取出凝胶,将凝胶小心放入事先配好的EB溶液(浓度为0.5μg·mL1.5.2基因组dna吸光度计算公式利用紫外分光光度计检测3种方法对商洛野生蕙兰叶片基因组DNA的吸光度(D)的测定,并分析其浓度和纯度。TE缓冲液作为空白对照,按仪器的使用说明进行操作,D值为5次测量后的平均值。根据D2结果与分析2.13通过该方法提取琼脂糖凝胶的电泳分析采用SDS、CTAB和高盐CTAB法提取商洛野生蕙兰基因组DNA,并进行0.8%琼脂糖凝胶电泳后的凝胶成像图谱(图1)。2.23提取方法的比较对3种方法所提DNA分别进行吸光度检测(表1),采用SDS、CTAB和高盐CTAB法测得D从表中可以看出,高盐CTAB法提取到DNA浓度和提取率最高,其次为CTAB法,SDS法最小,依次初步判定这3种方法提取的DNA效果为,高盐CTAB法最佳,CTAB法次之,SDS法相对较差。3种方法所提取dna的完整性以商洛野生蕙兰幼嫩叶片为材料,通过SDS、CTAB和高盐CTAB法提取基因组DNA。高盐CTAB法获得DNA产量高、质量好,但方法还有待完善。PVP是一种酚的络合物,同时含有亲水基团和亲油基团,较易溶解于极性较强的有机溶剂,可有效去除酚类物质。本研究在提取缓冲液中加入适量的PVP,有效去除了产物中的酚类物质。基因组DNA的降解对试验结果有一定影响,降解的原因有很多,如外界物理因素(温度、湿度)、化学因素(pH值、水解反应、氧化反应)和生物因素(酶解及微生物侵染)等。推测基因组DNA不同程度的降解,可能由于蕙兰叶片老化且木质化程度较高而导致组织研磨困难或操作时间过长造成。为得到尽可能完整的基因组DNA,在今后研究中应尽量简化操作步骤;提取过程应温和操作,避免剧烈震荡,用剪去尖端的枪头吸取上清液,吸取过程避免产生气泡,不要反复吸打助溶DNA;干燥DNA沉淀时,应注意沉淀的干燥程度,太干会导致沉淀不易重悬。另外,提取植物基因组DNA时要用氯仿-异戊醇抽提几次,抽提次数不够会导致蛋白等杂质过多,但抽提次数过多则会丢失部分DNA。对于蕙兰基因组DNA提取方法的具体优化还有待