高效氯氰菊酯诱导克氏原螯虾肝胰腺损伤模型的建立

高效氯氰菊酯诱导克氏原螯虾肝胰腺损伤模型的建立

氯氰菊酯，2-2-二氧基-3-（2-2-二氯乙烯基）-氰基-（3-羟色胺）-硝基。这是一种常见的农药，常用于清塘和海防寄生虫。菊酯类农药对鱼类、虾蟹类等水生动物的毒性很高,会造成许多组织器官的病变本研究以克氏原螯虾为试验对象,用高效氯氰菊酯诱导克氏原螯虾肝胰腺的损伤,探索克氏原螯虾肝胰腺损伤模型的合适时间与浓度,筛选肝胰腺损伤程度评价指标,为研究克氏原螯虾肝胰腺损伤的发生、发展,肝胰腺损伤的病理特征,以及评价肝胰腺损伤相关防治药物等奠定基础。1材料和方法1.1生化指标及检测试剂高效氯氰菊酯:购于武汉中博水产生物技术有限公司,药品有效成分含量为4.5%,以此配置成母液,根据试验需要稀释成不同浓度试剂,现配现用。生化指标试剂盒:SYSMEXCHEMIX-180全自动生化分析仪配套试剂盒。抗氧化酶和氧化产物检测试剂盒:南京建成生物工程公司生产的SOD(超氧化物歧化酶)酶试剂盒、CAT(过氧化氢酶)酶试剂盒和氧化产物MDA(丙二醛)试剂盒。苏木精、伊红染液:购买自武汉皮诺飞生物科技有限公司。1.2克氏原螯虾生长克氏原螯虾购自湖北省荆州市沙市农场洪塘分场,选择附肢完整、活力强、规格相近的克氏原螯虾用于试验,试验用虾体重(23±0.67)g。试验开始前将克氏原螯虾放入规格为(40cm×30cm×60cm)的水族箱中暂养7d,养殖水深10cm,试验用水为经充分曝气3d的自来水,水温(25±1)℃,连续充气增氧以保证水中溶氧充足。每天投喂小龙虾饲料2次(9:00和16:00),投喂量为虾体重的1%～3%,每天清除残饵与粪便并换水1/3,以保证水质清洁。1.3试验条件及程序建模浓度确定:根据文献建模天数确定:克氏原螯虾随机放入水族箱,30尾/箱。试验分成4组,设置2个试验组和2个空白对照组,每组10尾虾。试验前克氏原螯虾隔夜禁食。通过浓度确定试验结果,选择最适给药浓度进行试验,试验条件同模型浓度确定试验,观察克氏原螯虾的表现症状,于染毒后0.5、1、2、3、5、7、14d分别从空白组和试验组采集6尾虾取样。肝胰腺损伤程度评价指标筛选与病理切片观察:根据浓度确定试验设置给药浓度,给药方法同建模天数确定试验。在试验第0.5、1、2、3、5、7、14天时从水族箱随机采集6尾虾,采集血清测定生化指标TP(血清总蛋白)、ALP(碱性磷酸酶)和GLU(血糖),采集肝胰腺测定超氧化物歧化酶SOD、CAT和氧化产物MDA和病理切片观察。1.4样品采集与测定1.4.1虾肝胰腺的制备在各时间点取出克氏原螯虾,称重后用酒精擦拭头胸甲部分,用无菌注射器从克氏原螯虾围心腔采集血淋巴,放入无菌离心管中,在4℃,10000r/min条件下离心10min,取上层血清于-20℃保存,用于测量生化指标。快速解剖取出虾的肝胰腺,用预冷生理盐水清洗,滤纸吸干;取一小部分放入福尔马林中固定,用于制作病理切片;剩余部分置于-20℃冰箱保存,用于测定抗氧化酶和氧化产物。1.4.2抗氧化酶和抗氧化产物的测定血清生化指标测定:冻存血清置于4℃冰箱解冻,生化指标(AST、ALT、TP、ALP和GLU)测定使用SYSMEXCHEMIX-180全自动生化分析仪检测。肝胰腺抗氧化酶和氧化产物测定:克氏原螯虾肝胰腺样品解冻后称重,按照1∶9(W/V)比例加入预冷生理盐水,用玻璃匀浆器制备10%的组织匀浆,在4℃、3000r/min条件下离心10min,取上清液,4℃保存并于1天内进行测定。抗氧化酶指标SOD、CAT和氧化产物MDA的测定方法按照试剂盒说明书操作。组织病理切片观察:肝胰腺经酒精梯度脱水、二甲苯透明、石蜡包埋后组织切片,切片厚度4～5μm,HE染色,中性树胶封片,光学显微镜下观察。1.5计数方法及统计方法采用SPSS21.0软件进行统计学分析,各组数据均表示为平均数±标准差。多组数据的统计方法采用单因素方差分析(one-wayANOVA)法,当差异显著时,采用Duncan′s法进行多重比较;两两数据的比较方法采用独立样本2结果与分析2.1高效氯氰菊酯对克氏原螯虾alt活性的影响由图1可知,经过不同浓度高效氯氰菊酯给药后,与空白对照组相比,克氏原螯虾血清AST活性在0.5、1d时所有实验组皆没有显著变化;给药2d后,仅0.02μg/L实验组与空白对照组相比,AST活性有显著升高。不同浓度高效氯氰菊酯对克氏原螯虾ALT活性的影响见图1,0.02μg/L高效氯氰菊酯实验组在0.5d时与对照组相比无显著变化,在1d和2d时与对照组相比,ALT活性均显著升高。其他浓度给药组各时间点与对照组无显著差异。根据试验结果,确定0.02μg/L高效氯氰菊酯为建立克氏原螯虾肝胰腺损伤模型的适宜染毒模型浓度。2.2各组ast活性的变化根据2.1的结果,采用0.02μg/L高效氯氰菊酯对克氏原螯虾进行给药,各时间点克氏原螯虾的血清AST和ALT活性见图2。与空白对照组相比,染毒2d后实验组AST活性开始显著上升,至第3d达到峰值,差异极显著。第7d时有所下降,但仍显著高于空白对照组14d时AST活性和空白对照组之间已没有显著差异。实验组AST活性第2天至第5天显著高于0.5天实验组的AST活性,总体呈现先上升后下降的趋势。各时间点对照组AST值无显著变化。与空白对照组相比,1d后实验组的血清ALT活性显著升高,3d时ALT活性达到峰值,在5d时开始下降并持续到第7d,但仍显著高于空白对照组。第14天时实验组ALT活性恢复至正常水平。实验组ALT活性在第1天至第3d显著高于0.5d实验组的ALT活性,第5d时ALT活性接近0.5d时ALT活性,总体呈现先上升后下降的趋势。各时间点对照组ALT值无显著变化。根据试验结果,在第3d时,血清转氨酶活性与空白对照组相比有显著变化;第3d时血清转氨酶活性与实验组0.5d时相比有显著变化。因此确定3d作为克氏原螯虾肝胰腺损伤模型的适宜染毒模型天数。2.3克氏原生殖虾肝脏胰腺损伤程度评价指标的选择2.3.1alp活性测定由表1可以看出,在试验开始后至第2d,实验组TP含量相比空白对照组略微下降,无显著差异(根据表1,对比对照组ALP活性在2d时升高,第3d降低,第5d升高,变化均没有显著差异(2.3.2实验组与空白对照组肝胰腺组织sod活性的变化高效氯氰菊酯对克氏原螯虾肝胰腺CAT活性影响随时间变化情况如图3所示,各时间点空白对照组CAT值无明显变化(由图3可知,与空白对照组相比,实验组SOD活性在第2d开始显著升高(根据结果,对比空白对照组,肝胰腺MDA的含量在试验第2d显著增加(2.4克氏原螯虾肝脏组织结构对0.20μg/L实验组的不同时间的组织切片观察发现,试验开始0.5d后,空白对照组克氏原螯虾肝胰腺小管呈星形,结构完整,细胞饱满,分布均匀,肝管上可见少量棕色颗粒(图4-1)。而0.5d后克氏原螯虾肝管上皮细胞内可见大量液泡,与0.5d空白对照组比较,未见淤血或炎症反应,肝管上棕色颗粒数量增多(图4-2)。处理1d后切片显示,克氏原螯虾肝管排列紧密,肝管上皮细胞内可见大量液泡,肝管上可见少量棕色颗粒,与对照组比较,管腔未见明显变窄(图4-3)。2d时肝管上皮细胞内可见大量液泡,管腔未见明显变窄,肝管上可见少量棕色颗粒,局部肝管排列疏松,间隙增宽,间质可见少量炎性细胞渗出,炎症反应出现(图4-4)。实验组给药3d时,肝管排列较紧密,肝管上可见少量棕色颗粒,肝管上皮细胞内可见大量液泡,少量液泡明显增大,间质偶见炎性细胞渗出(图4-5)。第5d时,实验组肝管上可见大量液泡,肝管上可见少量大液泡,并可见破裂后相互融合,肝管上可见少量棕色颗粒,肝管排列疏松,间隙大(图4-6),肝细胞出现较明显损伤且损伤不可逆转。第7d时,肝细胞坏死溶解(黑色箭头),可见棕色颗粒增多,肝管上皮细胞内可见大量液泡管腔变大(图4-7)。实验组14d时,棕色颗粒数量减少,肝细胞肿大,细胞数量明显减少,肝胰腺小管基膜破裂,肝胰腺小管结构受损严重(图4-8)。3讨论3.1血液中抗氧化酶系统tpALT主要存在于细胞质内,而AST主要存在于线粒体和细胞质中。正常情况下二者只有极少量释放入血液,当肝组织受到急性损伤时,这两种酶会随组织损伤逸出脏器,使血清中转氨酶的活性显著升高血清总蛋白TP为血清中所含各种蛋白质的总称,TP主要由肝脏合成,当血液中TP降低,则反映肝脏合成功能和肝实质细胞储备功能的下降3.2氯氰菊酯对克氏原生殖虾肝胰腺的抗菌效果的影响SOD和CAT是机体抗氧化系统的关键酶,MDA是脂质过氧化的代谢产物,这3个指标的变化能反